一种ATP含量测定试剂盒及其方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105699507A(43)申请公布日2016.06.22(21)申请号201610039407.4(22)申请日2016.01.21(71)申请人苏州科铭生物技术有限公司地址215000江苏省苏州市工业园区星湖街218号生物纳米园A3楼101B室(72)发明人赵林川(74)专利代理机构上海申新律师事务所31272代理人夏海天(51)Int.Cl.G01N30/02(2006.01)G01N30/06(2006.01)G01N30/26(2006.01)权利要求书2页说明书5页(54)发明名称一种ATP含量测定试剂盒及其方法(57)摘要本发明公开了一种ATP含量测定试剂盒及其方法，该试剂盒包括：由浓高氯酸溶于蒸馏水后制成的试剂一，由氢氧化钠溶于蒸馏水后制成的试剂二，由十二水合磷酸氢二钠组成的试剂三，由二水合磷酸二氢钠组成的试剂四，由ATP组成的试剂五。本发明的方法改进了ATP的提取过程，通过先加入酸性提取液充分提取后，再加入碱性提取液中和可以除去样本中杂质的影响。本发明的方法的最低检测限达到0.1μmol/mL，相比传统分光光度法显著提高。本发明的试剂盒的试剂成本仅为无水甲醇，磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，检测成本大大降低。本发明的方法通过峰面积和保留时间分别定量和定性，显著提高了检测准确性。CN105699507ACN105699507A权利要求书1/2页1.一种ATP含量测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：试剂一，液体×1瓶，4℃保存，由一定量的浓高氯酸溶于蒸馏水后制成，置于60mL试剂瓶中；试剂二，液体×1瓶，4℃保存，由一定量的氢氧化钠溶于蒸馏水后制成，置于60mL试剂瓶中；试剂三，粉剂×1瓶，由一定量的十二水合磷酸氢二钠组成，置于15mL试剂瓶中；试剂四，粉剂×1瓶，由一定量的二水合磷酸二氢钠组成，置于10mL试剂瓶中；试剂五，粉剂×2支，每支由一定量的ATP组成，置于1.5mLEP管中。2.根据权利要求1所述的ATP含量测定试剂盒，其特征在于：所述试剂一中浓高氯酸的体积为2mL浓高氯酸，蒸馏水的体积为58mL；所述试剂二中的氢氧化钠的质量为0.96g，蒸馏水的体积为60mL；所述试剂三中的十二水合磷酸氢二钠的质量为11.2833g；所述试剂四中的二水合磷酸氢二钠的质量为10.689g；所述试剂五中的每支EP管中的ATP的质量为5mg。3.一种采用如权利要求2所述的试剂盒的ATP含量测定方法，其特征在于，基于高效液相色谱法，包括以下步骤：步骤1仪器和用品的准备；高效液相色谱仪、低速离心机、溶剂抽滤装置、50个0.22μm水系针头式过滤器、0.45μm水系滤膜、0.45μm有机系滤膜、4.6×150mm的C18柱、可调式移液器、50个2mL的样品瓶、300mL的色谱级甲醇和蒸馏水；步骤2流动相缓冲液基质的配制；用一定量的蒸馏水将所述试剂三和所述试剂四溶解后倒入1000mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，形成流动相缓冲液基质；步骤3溶剂的除杂；将蒸馏水1000mL、流动相缓冲液基质1000mL分别用0.45μm的水系滤膜抽滤，将甲醇300mL用0.45μm的有机系滤膜抽滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱；步骤4流动相的配制；将抽滤完毕的流动相缓冲液基质与甲醇以配比为99.9：0.1（v/v）混合，即取999mL缓冲液基质与1mL甲醇混合；步骤5将抽滤完毕的甲醇和蒸馏水分别配比成100%的甲醇、10%的甲醇、蒸馏水，各250mL；步骤6溶剂的脱泡；将步骤4和步骤5中的溶剂分别超声20min，以脱去每种溶剂中的气泡，防止堵塞色谱柱；步骤7ATP的提取；1）组织的处理：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：（5~10）的比例，进行冰浴匀浆，采用离心机4000g，常温下离心15min，取上清液，加入等体积的所述试剂二，混匀，采用离心机4000g，常温下离心15min，取上清，针头式过滤器过滤后待测；2）细胞或细菌的处理：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞2CN105699507A权利要求书2/2页4数量（10个）：试剂一体积（mL）为500~（1000：1）的比例，超声波破碎细菌或细胞；接着采用离心机4000g，常温下离心15min，取上清液，加入等体积的所述试剂二，混匀，再采用离心机4000g，常温下离心15min，取上清，针头式过滤器过滤后待测；步骤8标准品的配制；在所述试剂五中加入1mL蒸馏水，配成5mg/mL的母液，将所述母液用蒸馏水分别稀释成100μg/mL、80μg/mL、60μg/mL、40μg/mL和20μg/mL的ATP标准品溶液，并分别经针头式过滤器过滤后待测；步骤9ATP含量测定操作步骤；1）开