一种基于磁珠包被的微量核酸测序前处理方法及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106701993A(43)申请公布日2017.05.24(21)申请号201710086540.X(22)申请日2017.02.17(71)申请人苏州贝斯派生物科技有限公司地址215000江苏省苏州市工业园区星湖街218号A2楼426单元(72)发明人魏冬凯丁国徽吴洁(74)专利代理机构南京利丰知识产权代理事务所(特殊普通合伙)32256代理人王锋(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12N15/10(2006.01)权利要求书2页说明书16页附图1页(54)发明名称一种基于磁珠包被的微量核酸测序前处理方法及试剂盒(57)摘要本发明公开了一种基于磁珠包被的微量核酸测序前处理方法及试剂盒。所述方法包括：先将待处理DNA进行磁珠包被，其后将磁珠包被的待处理DNA进行末端修复，然后纯化，留下磁珠，进行加A反应，之后再纯化，留下磁珠，进行连接反应，之后再纯化，丢弃磁珠，进行PCR反应，PCR反应完成后，再加入磁珠进行纯化，得到处理后的DNA。本发明使用磁珠包被DNA，有效减少了微量核酸在测序前处理过程中被转移的次数，从而大大降低了核酸在测序前处理过程中的损耗，反应条件温和，同时也降低了DNA损伤，将处理微量核酸测序前处理成功率提高至90％以上，较经典的核酸测序前处理方法，有着高成功率，高质量，低起始量的特点；且所用试剂原料成本低廉，简单易得。CN106701993ACN106701993A权利要求书1/2页1.一种基于磁珠包被的微量核酸测序前处理方法，其特征在于包括：先将待处理DNA进行磁珠包被，其后将磁珠包被的待处理DNA进行末端修复，然后纯化，留下磁珠，进行加A反应，之后再纯化，留下磁珠，进行连接反应，之后再纯化，丢弃磁珠，进行PCR反应，PCR反应完成后，再加入磁珠进行纯化，得到处理后的DNA。2.根据权利要求1所述的基于磁珠包被的微量核酸测序前处理方法，其特征在于包括：进行磁珠包被时，所述待处理DNA与磁珠的体积用量比为0.5～1.2:1.5～2.0，和/或，所述磁珠为AmpureXP磁珠。3.根据权利要求1所述的基于磁珠包被的微量核酸测序前处理方法，其特征在于还包括：向磁珠包被的待处理DNA中加入第一试剂以进行末端修复，所述第一试剂包含：10XT4DNA连接缓冲液、牛血清蛋白、ATP、dNTPs、T4磷酸化激酶、T4DNA聚合酶、Klenow大片段聚合酶和超纯水。4.根据权利要求3所述的基于磁珠包被的微量核酸测序前处理方法，其特征在于，所述末端修复的温控程序为：先于10℃～15℃下保温5min～20min，之后于20℃～30℃下保温5min～20min，最后于4℃保存；和/或，所述第一试剂的pH为7.3～8.5，所述第一试剂包含：10XT4DNA连接缓冲液2～20体积份，1mg/mL牛血清蛋白溶液2～10体积份，10mMATP溶液2～10体积份，10mMdNTPs溶液1～5体积份，T4磷酸化激酶溶液2～10体积份，T4DNA聚合酶溶液2～10体积份，Klenow大片段聚合酶溶液0.5～1.5体积份，超纯水10～50体积份。5.根据权利要求3所述的基于磁珠包被的微量核酸测序前处理方法，其特征在于还包括在进行加A反应前加入第三试剂，所述第三试剂包含：10×Klenow聚合缓冲液、腺嘌呤、Klenow聚合酶和超纯水。6.根据权利要求5所述的基于磁珠包被的微量核酸测序前处理方法，其特征在于，所述加A反应的温控程序为：先于30℃～40℃下保温5min～60min，之后于4℃保存；和/或，所述第三试剂的pH为7.3～8.5，所述第三试剂包含：10×Klenow聚合缓冲液2～10体积份、1mM腺嘌呤溶液2～20体积份、exo-Klenow聚合酶溶液2～10体积份和超纯水20～50体积份。7.根据权利要求5所述的基于磁珠包被的微量核酸测序前处理方法，其特征在于还包括在进行连接反应前加入第四试剂，所述第四试剂包含：2×DNA连接缓冲液、DNA连接酶、Illumina测序接头和超纯水。8.根据权利要求7所述的基于磁珠包被的微量核酸测序前处理方法，其特征在于，所述连接反应的温控程序为：先于20℃～30℃下保温5min～20min，之后于4℃保存；和/或，所述第四试剂的pH为7.3～8.5，所述第四试剂包含：2×DNA连接缓冲液5～25体积份、DNA连接酶溶液1～5体积份、Illumina测序接头溶液0.5～3体积份和超纯水10～50体积份。9.根据权利要求7所述的基于磁珠包被的微量核酸测序前处理方法，其特征在于还包括：丢弃磁珠后，进行PCR反应之前加入第五试剂进行DNA洗脱，向洗脱后的DNA中加入第六试剂进行PCR反应；其中，所述第五试剂包含：三羟