核酸样本处理方法、测序方法和试剂盒.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN116144735A(43)申请公布日2023.05.23(21)申请号202310178386.4C12Q1/6869(2018.01)(22)申请日2019.09.16(66)本国优先权数据201910741127.12019.08.12CN(62)分案原申请数据201910868866.72019.09.16(71)申请人深圳市真迈生物科技有限公司地址518000广东省深圳市罗湖区清水河街道清水河社区清水河一路112号罗湖投资控股大厦裙楼502A及502B、裙楼602(72)发明人张萌刘丽春冯燕李改玲林群婷甘广丽(51)Int.Cl.权利要求书2页说明书11页C12Q1/6806(2018.01)序列表（电子公布）附图2页(54)发明名称核酸样本处理方法、测序方法和试剂盒(57)摘要本发明提供一种DNA样本处理方法、一种测序方法和一种试剂盒。所称的对DNA样本进行处理的方法，包括在第一预混合体系中对所述DNA进行片段化、末端修复和加dA尾处理，获得第一产物；所称的第一预混合体系包括预混合酶，所称的预混合酶包括DNA片段化酶、多核苷酸激酶和DNA聚合酶。基于测试试验以及优化的混合酶体系，使多种酶混合于同一反应体系中、一步实现DNA断裂、末端修复和加dA尾，简便快捷，节省上机前样本处理的操作时间，利于工业化。CN116144735ACN116144735A权利要求书1/2页1.一种对DNA样本进行处理的方法，其特征在于，包括在第一预混合体系中对所述DNA进行片段化、末端修复和加dA尾处理，获得第一产物；所述第一预混合体系包括预混合酶，所述预混合酶包括DNA片段化酶、多核苷酸激酶和DNA聚合酶，所述第一预混合体系还包括Mg2+，所述Mg2+的浓度为60mM～100mM。2.权利要求1的方法，其特征在于，所述DNA不小于5Kbp；任选的，所述第一产物的大小为100～400bp；任选的，所述第一产物的大小为100～300bp；任选的，所述第一预混合体系中，所述DNA的含量为10ng～60ng；任选的，所述第一预混合体系中，所述DNA的含量为15ng～50ng。3.权利要求1‑2任一方法，其特征在于，所述Mg2+的浓度为60mM～75mM；任选的，DNA聚合酶选自DNA聚合酶I和TaqDNA聚合酶中的至少一种；任选的，所述DNA聚合酶由DNA聚合酶I的Klenow片段和TaqDNA聚合酶组成；任选的，所述多核苷酸激酶为T4多核苷酸激酶。4.权利要3的方法，其特征在于，所述第一预混合体系中，所述DNA片段化酶的含量是所述多核苷酸激酶的至少2倍；任选的，所述第一预混合体系中，所述DNA片段化酶、多核苷酸激酶、DNA聚合酶I的Klenow片段和TaqDNA聚合酶的量的比例为[25,35]:[6,10]:[1,3]:[3,5]。5.权利要求1‑4任一方法，其特征在于，还包括在第二预混合体系中使所述第一产物的至少一个末端带有预设序列，获得第二产物；所述第二预混合体系包括所述第一预混合体系和所述预设序列；任选的，所述第二预混合体系还包括连接酶；任选的，所述连接酶为T4DNA连接酶。6.权利要求5的方法，其特征在于，所述预设序列为双链DNA，由互补的第一链和第二链组成，所述预设序列具有至少一个单链末端；任选的，所述第一链的5'末端具有磷酸基团；任选的，所述第二链的3'末端不具有羟基；任选的，80℃≥(Tm1‑Tm2)≥10℃并且90℃≥Tm1≥50℃，Tm1为所述第一链的溶解温度，Tm2为所述第二链的溶解温度；任选的，所述Tm1为71℃，所述Tm2为45.6℃；任选的，所述预设序列选自SEQIDNO：1和SEQIDNO：2、SEQIDNO：1和SEQIDNO：3和/或SEQIDNO：4和SEQIDNO：5。7.一种对DNA序列进行测定的方法，其特征在于，包括：利用权利要求1‑4任一方法对所述DNA进行处理，获得所述第一产物；利用权利要求5‑6任一方法对所述第一产物进行处理，获得所述第二产物；使所述第二产物连接到固相基质表面上，对所述第二产物进行测序，以确定所述DNA的至少一部分序列。8.权利要求7的方法，其特征在于，所述第二产物带有光学可检测标记；任选的，所述第二产物带有荧光分子；任选的，所述固相基质表面上具有探针，所述第二产物通过所述探针连接到所述固相2CN116144735A权利要求书2/2页基质表面上，所述探针的长度为20‑80nt；任选的，所述预设序列为双链DNA，由互补的第一链和第二链组成，所述预设序列具有一个单链末端，所述单链末端位于所述第一链；任选的，所述第一链与所述探针完全互补，所述第一链不长于所述探针；任选的，Tm2‑5℃≤T≤Tm1‑5℃，T为所述使第二产物连接到