一种基于磁珠法的无醇病毒核酸提取试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109722431A(43)申请公布日2019.05.07(21)申请号201910054549.1(22)申请日2019.01.21(71)申请人上海科华生物工程股份有限公司地址200233上海市徐汇区钦州北路1189号(72)发明人王金辉方琴张健蒋淼(74)专利代理机构上海世圆知识产权代理有限公司31320代理人陈颖洁王佳妮(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)C12N1/06(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图2页(54)发明名称一种基于磁珠法的无醇病毒核酸提取试剂盒(57)摘要本发明提供了一种基于磁珠法的无醇病毒核酸提取试剂盒，含有裂解液；磁珠溶液；蛋白酶K；polyA溶液；去蛋白液；洗涤液；缓冲液。本发明还提供了采用上述的试剂盒提取核酸的方法，先加入样本、裂解液和磁珠进行混匀，然后边裂解边捕获核酸分子，最后分别采用特有的无醇去蛋白液和洗涤液洗涤去除磁珠表面的蛋白质和盐离子等杂质。与常规的病毒核酸提取方法相比较，操作步骤简单，不需要单独加入结合液，实现了裂解和结合同时进行，DNA和RNA共提；整个操作过程中不加入乙醇或异丙醇，抑制物质残留少，实验步骤简便，整个流程下来仅需要40min左右；安全无污染，无氯仿苯酚等有毒试剂，既可以手工操作也可以用于自动化平台。CN109722431ACN109722431A权利要求书1/1页1.一种基于磁珠法无醇病毒核酸提取试剂盒，其特征在于包括如下试剂：裂解液，所述的裂解液中含有浓度为25-75mM的Tris-HCL，所述的Tris-HCL的pH为8.0，浓度3-5M的异硫氰酸胍，质量百分比浓度为5-15%的聚多卡醇，质量百分比浓度为5-15%的PEG6000；磁珠溶液，所述的磁珠溶液的浓度为50-100mg/mL，所述的磁珠为硅羟基或羧基修饰的磁珠；蛋白酶K，所述的蛋白酶K的浓度为50-100mg/mL；polyA溶液，所述的polyA的浓度为10-50mM；去蛋白液，所述的去蛋白液中含有浓度为1-3M的异硫氰酸胍，浓度为的10-20mMTris-HCL，所述的Tris-HCL的pH为8.0-9.0，质量百分比浓度为5-10%的PEG6000；洗涤液，所述的洗涤液中含有浓度为10-50mM的Tris-HCL，所述的Tris-HCL的pH为8.0-9.0，质量百分比浓度为5-10%的PEG6000，浓度为200-300mM的Nacl；缓冲液，所述的缓冲液为浓度为10-20mM的Tris-HCL，所述的Tris-HCL的pH为pH8.0-9.0。2.采用权利要求1所述的试剂盒提取核酸的方法，其特征在于包括如下步骤：一个对血浆或血清中的病毒进行裂解的步骤：在2mL离心管中加入300-500µL的血清或血浆样本，加入500-1000µL的裂解液、10-30µL含有磁珠的溶液，20-50µL的蛋白酶K溶液、5-10µL的polyA溶液，涡旋振荡1-2min至样本充分混匀，然后颠倒混匀10-15min；一个吸附核酸和去除杂蛋白的步骤：将步骤1）的离心管放置于磁力架上静置30秒，磁珠完全吸附后，吸去液体，将离心管从磁力架上取下，加入500-1000μL的去蛋白液，振荡混匀5min，将离心管放置于磁力架上静置1-2min，磁珠完全吸附后，吸去液体；一个对盐离子进行洗涤的步骤：将步骤2）的离心管从磁力架上取下，加入700-1000μL的洗涤液，振荡混匀2min，将离心管放置于磁力架上静置1-2min，磁珠完全吸附后，吸去液体；一个对DNA进行洗脱的步骤，将步骤3）的离心管从磁力架上取下，加入50-100μL缓冲液，振荡混匀，置于50-60℃，孵育5-10min，期间颠倒混匀3次，将离心管放置于磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，将核酸溶液转移至一个新离心管中，完成核酸的提取。2CN109722431A说明书1/6页一种基于磁珠法的无醇病毒核酸提取试剂盒技术领域[0001]本发明属于生物工程领域涉及一种检测试剂盒，具体来说是一种基于磁珠法的无醇病毒核酸提取试剂盒。背景技术[0002]病毒的结构相对简单，由外面的衣壳蛋白和内部的核酸物质组成，根据核酸物质可以将病毒分为DNA病毒或RNA病毒。随着分子生物学的发展，对疾病相关病毒进行检测和分型是分子检测的一个重要应用领域，而从生物材料中高效、简便的提取和纯化目的核酸是分子检测的关键技术。目前病毒核酸纯化技术主要分为三种，分别为传统法、柱膜法和磁珠法。[0003]传统的核酸纯化主要是利用变性剂和表面活性剂进行裂解，释放出核酸后用苯酚、氯仿进行抽提去除蛋白等杂质，然后用乙醇或异丙醇进行沉淀，去除上清后获得核酸沉淀，然后用TB或TE缓冲液进行溶解。该方法步