磷脂酶、编码基因、制备方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106701714A(43)申请公布日2017.05.24(21)申请号201510464998.5(22)申请日2015.07.31(71)申请人丰益(上海)生物技术研发中心有限公司地址200137上海市浦东新区高东工业区高东路118号A区(72)发明人徐正军周美凤许骏杨天奎(74)专利代理机构上海专利商标事务所有限公司31100代理人韦东(51)Int.Cl.C12N9/20(2006.01)C12N15/55(2006.01)C12N15/63(2006.01)C11B3/00(2006.01)A23K1/165(2006.01)权利要求书1页说明书18页序列表9页附图5页(54)发明名称磷脂酶、编码基因、制备方法及其应用(57)摘要本发明提供磷脂酶、编码基因、制备方法及其应用。具体而言，本发明提供一种分离的多肽，它含有：(1)SEQIDNO:2第21－565位氨基酸序列；或(2)在(1)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQIDNO:2第21－565位氨基酸序列所具备的磷脂酶活性的由(1)衍生的多肽。本发明还涉及编码所述多肽的多核苷酸序列，含有所述多核苷酸序列的核酸构建体，所述多核苷酸序列或核酸构建体的宿主细胞，含有所述多肽的组合物，以及所述多肽的用途。CN106701714ACN106701714A权利要求书1/1页1.一种分离的多肽，它含有：(1)SEQIDNO:2第21－565位氨基酸序列；或(2)在(1)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQIDNO:2第21－565位氨基酸序列所具备的磷脂酶活性的由(1)衍生的多肽。2.如权利要求1所述的分离的多肽，其特征在于，所述分离的多肽：(a)如SEQIDNO:2所示，或由SEQIDNO:2第21－565位氨基酸残基构成；或(b)含有选自前导肽、末端延伸、GST、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点的氨基酸序列。3.一种分离的多核苷酸序列，选自：(1)编码权利要求1或2所述的分离的多肽的多核苷酸序列；(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列；和(3)(1)或(2)所述的序列的长15－30个碱基的片段。4.如权利要求3所述的多核苷酸序列，其特征在于，选自：(1)SEQIDNO:1所示的多核苷酸序列；(2)(1)所述的多核苷酸序列的互补序列；和(3)(1)或(2)所述的序列的长15－30个碱基的片段。5.一种核酸构建体，其特征在于，该核酸构建体包含权利要求3或4所述的多核苷酸序列。6.如权利要求5所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体是表达载体。7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5或6所述的核酸构建体，或含有权利要求3－4中任一项所述的多核苷酸。8.一种组合物，含有权利要求1－2中任一项所述的多肽。9.一种使用权利要求1或2所述的多肽进行油脂酶法脱胶、磷脂改性、改良饲料、或制备食品或药品的方法，其特征在于，所述方法包括使待处理物质与权利要求1或2所述的多肽接触，优选地，所述接触在以下一个或多个条件下进行：(A)温度为37℃-60℃，优选45±5℃；和/或(B)pH为3.7-7.0，优选3.4-4.5；和/或(C)0-3.0mM的钙离子。10.权利要求1或2所述的多肽在油脂精炼、磷脂改性、饲料改良剂、食品制备和医药制备中的应用。2CN106701714A说明书1/18页磷脂酶、编码基因、制备方法及其应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及磷脂酶、编码基因、制备方法及其应用。背景技术[0002]磷脂酶(Phospholipase，PL)是生物体内存在的能水解甘油磷脂的酶，根据磷脂酶水解甘油磷脂的位点(RichmondG.S.等，Int.J.Mol.Sci.2011，12:588-612)不同，可将磷脂酶分为磷脂酶A1(PLA1)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶B(PLB)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)以及溶血磷脂酶A(LysoPLA)，如下式所示：[0003][0004]式中的R1和R2为脂肪酰基；R3为氨基醇类，如胆碱、乙醇胺、肌醇以及丝氨酸等。[0005]PLA1能够水解二脂肪酰基磷脂的Sn-1位酰基酯键，产生溶血磷脂和脂肪酸。PLA2则是能够水解Sn-2位的酰基酯键，产生溶血磷脂和脂肪酸。PLB则是能水解二脂肪酰基磷脂的Sn-1位和Sn-2位的两个酰基酯键产生甘油磷酰胆碱和游离脂肪酸的磷脂酶，该酶也同时具有溶血磷脂酶的活性。PLC是能够水解甘油骨架和磷酸基之间的磷酸酯键产生二磷脂酰甘油和磷酸极性醇酯(如磷酸胆碱、