重组尿嘧啶‑DNA糖苷酶及其编码基因、制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107828758A(43)申请公布日2018.03.23(21)申请号201711112394.X(22)申请日2017.11.13(71)申请人江苏众红生物工程创药研究院有限公司地址213125江苏省常州市新北区云河路518号(72)发明人马永王安良赵百学(51)Int.Cl.C12N9/24(2006.01)C12N15/56(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12N1/21(2006.01)C12Q1/6848(2018.01)权利要求书1页说明书7页序列表2页附图9页(54)发明名称重组尿嘧啶-DNA糖苷酶及其编码基因、制备方法和应用(57)摘要本发明属于生物工程基因领域，涉及一种重组尿嘧啶-DNA糖苷酶及其编码基因，以及其表达、纯化及在各种核酸扩增中的应用。本发明重组尿嘧啶-DNA糖苷酶编码基因在大肠杆菌中能高效可溶表达，通过两步纯化工艺即可获得纯度较高的重组UNG酶，且重组UNG酶具有较好的生物学活性和较大的应用价值。CN107828758ACN107828758A权利要求书1/1页1.一种重组UNG酶，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一种编码权利要求1所述重组UNG酶的基因，其碱基序列如SEQIDNO：2所示。3.一种包含了权利要求2所述编码重组UNG的基因的载体，所述载体为pET28a。4.一种包含了权利要求3所述载体的大肠杆菌宿主菌株，所述大肠杆菌宿主菌株为BL21(DE3)。5.一种重组UNG酶在大肠杆菌中高效可溶表达方法，包括如下步骤：1).挑取一个含有权利要求4所述的大肠杆菌菌株单菌落，接入LB培养液，于37℃培养过夜；2).取10mL过夜培养物接入TB或LB培养液中，于37℃震荡培养至对数中期(A600＝1.0)；3).在培养物中加入IPTG至1mmol/L，于25℃震荡过夜诱导表达，4℃以12000rpm离心3min收集含有重组UNG酶的大肠杆菌菌体沉淀。所述TB或LB培养液中均含有卡那霉素25-50μg/mL。6.一种重组UNG酶的纯化方法，包括如下步骤：1).将收集得到的含有诱导重组UNG酶大肠杆菌菌体沉淀，用预冷的结合缓冲液BufferA重悬，并于4℃高速离心处理。2).吸去上清，每克菌体加入结合缓冲液BufferA3-10mL，搅动，使菌体悬起。3).每克菌体加入3-10μL浓度为100mmol/L的PMSF，3-100μL浓度为100mg/mL的溶菌酶，于冰上搅动。4).破碎菌体，于冰浴中超声，并于4℃以12000rpm高速离心5min收集上清，0.22μm滤膜过滤备用。5).IMAC亲和层析，合并各收集峰中样品并以0.22μm滤膜过滤备用。6).进一步以凝胶过滤层析，得到所需目的产物。7.根据权利要求6所述的纯化方法，所述IMAC亲和层析选用的结合缓冲液为BufferA：20mMTris-HCl，20mM咪唑，300mMNaCl，pH＝8.0；洗脱缓冲液为BufferB：20mMTris-HCl，300mMNaCl，300mM咪唑，pH＝8.0；所述凝胶过滤层析，选用的结合以及洗脱缓冲液为BufferC:20mMTris-HCl，50mMNaCl，pH＝8.0，0.22μm滤膜过滤备用。8.如权利要求1所述的重组UNG酶在预防非特异性PCR扩增和污染、保证PCR结果准确性中的应用。2CN107828758A说明书1/7页重组尿嘧啶-DNA糖苷酶及其编码基因、制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于生物工程基因领域，涉及一种重组尿嘧啶-DNA糖苷酶及其编码基因，以及其表达、纯化和在各种核酸扩增中的应用。背景技术[0002]在PCR操作过程中，最容易出现“污染”问题，原因主要有如下几种情况：1.模板的交叉污染：在样品采集或处理中，气溶胶、加样器取样时的泡沫或其他原因引起样品或模板的交叉污染，造成假阳性，属于正常DNA(由A、T、G、C四种碱基组成)引起的污染；2.扩增产物的污染：在扩增过程中，将碱基T置换成U，使得扩增产物中含有dU-DNA(由A、U、G、C四种碱基组成)，由于产物量特别大，容易溢漏引起污染，造成假阳性；3.核酸酶、蛋白酶的污染造成假阳性；在这三种情况中最为严重是第二种，即称之为：“残留污染”，因为PCR扩增的放大倍数高达千万倍，而且在实际应用中扩增一直在反复进行，造成扩增产物的大量堆积，难于将其控制降解，即使是荧光定量PCR也很难避免扩增产物的污染，为了使得PCR结果更加可靠、准确，有必要在反应管完全封闭后于管内通过酶或其他方法，将操作过程中可能带入的残留污染物破坏，使其不能成为新一轮扩增的模板。[0003]UNG酶，即尿嘧啶-DNA糖苷酶(Uracil-DNA