一种磷脂酶D的编码基因及其表达和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110004124A(43)申请公布日2019.07.12(21)申请号201910148529.0(22)申请日2019.02.28(71)申请人江南大学地址214122江苏省无锡市蠡湖大道1800号申请人广东双骏生物科技有限公司(72)发明人龚劲松史劲松许正宏侯海娟陈杰鹏段丽丽(51)Int.Cl.C12N9/16(2006.01)C12N15/55(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12P13/06(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图4页(54)发明名称一种磷脂酶D的编码基因及其表达和应用(57)摘要本发明为一种磷脂酶D的编码基因及其表达和应用，提供了一种利用大肠杆菌E.coliBL21表达重组磷脂酶D并利用其产生磷脂酰丝氨酸的方法。该方法包括对重组质粒pET-28a(+)-sspld的构建、重组质粒转化至E.coliBL21及利用重组菌催化产生磷脂酰丝氨酸。重组菌株可成功表达磷脂酶D，酶活达到17.07U/mL。通过诱导条件优化，重组菌酶活最高可达38.58U/mL。经HPLC检测，该酶具有良好的转磷脂酰基能力，能以卵磷脂和L-丝氨酸为底物合成产物磷脂酰丝氨酸，转化率可达28％，产量达到1.34g/L。该重组磷脂酶D发酵周期短，催化性能良好，为其实际应用奠定了基础。CN110004124ACN110004124A权利要求书1/1页1.一种磷脂酶D，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种编码权利要求1所述的磷脂酶D的基因序列，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.包含SEQIDNO.2所示核苷酸序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。4.一种表达磷脂酶D的重组质粒，其特征在于：包括权利要求2所述的基因序列，所用质粒为pET-28a，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。5.一种表达磷脂酶D的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株中导入由权利要求4中所述表达磷脂酶D的重组质粒。6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于：所述重组质粒的宿主菌为大肠杆菌EscherichiacoliDH5α，BL21或Rosetta。7.权利要求5所述的重组菌株在生产磷脂酰丝氨酸中的应用。8.一种生产磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用权利要求5所述的重组菌株所产生的磷脂酶D催化底物大豆卵磷脂和丝氨酸的反应，在30-70℃条件下反应2-30h，得到所述磷脂酰丝氨酸。2CN110004124A说明书1/6页一种磷脂酶D的编码基因及其表达和应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种磷脂酶D的编码基因及其重组表达和在磷脂酰丝氨酸合成中的应用。背景技术[0002]磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)于1942年由JordiFloch首次提取出来，其提取来源为牛脑，随后对其进行了分子结构的定性分析[FOLCHJ.JournalofBiologicalChemistry,1942,146:35-44]。它是磷脂中一种能够调控膜蛋白功能状态的磷脂[冯雷刚等.食品研究与开发,2006,27(9):191-193]，其在细胞膜的磷脂双分子层中占有10％-20％。近年来，磷脂酰丝氨酸广泛应用于医疗、保健行业，主要用于治疗脑衰老和修复脑损伤，且疗效显著，更是作为“脑专一性营养物质”而备受关注[BIRGERB,etal.CellDeath&Differentiation,2016,23(6):962-978]。随着研究的不断深入，除了其营养价值外，许多其他的用途和功能也逐渐被发现。磷脂酰丝氨酸主要具有以下功能：(1)改善记忆力，缓解脑疲劳，治疗老年痴呆；(2)修复大脑损伤，治疗儿童多动症；(3)缓解精神压力，治疗抑郁症；(4)改善橡胶性能[MCDANIELMA,etal.Nutrition,2003,19(11):957-975；王兆明等.食品工业科技,2014,35(19):362-367]。[0003]磷脂酰丝氨酸对人体生命活动具有关键作用，可是其在自然界中的含量较少，随着目前人们对磷脂酰丝氨酸需求量日益增加，高效制备磷脂酰丝氨酸的方法越来越受到广泛关注。国内外制备磷脂酰丝氨酸的方法已研究多年，主要包括两方面：提取法和生物酶转化法。提取法是指通过有机溶剂从植物种籽和动物细胞中萃取获得磷脂酰丝氨酸，酶转化法是指利用磷脂酶D(phospholipaseD，PLD)的转磷脂酰作用，生物催化合成磷脂酰丝氨酸。但提取法获得的磷脂酰丝氨酸得率较低、且具有携带疯牛病等动物流行病毒的安全风险，而酶转化法具备成本较低、操作简单、反应工艺绿色环保等优点，逐渐成为了合成磷脂酰丝氨酸