自然杀伤细胞的体外纯化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106834227A(43)申请公布日2017.06.13(21)申请号201611219859.7(22)申请日2016.12.26(71)申请人深圳精准医疗科技有限公司地址518000广东省深圳市南山区科园路1008号软件产业基地1栋裙楼4层04、06号室(72)发明人李扬兮江海达易吉辉许春莲毛侃琅(74)专利代理机构广州华进联合专利商标代理有限公司44224代理人徐春祺(51)Int.Cl.C12N5/0783(2010.01)权利要求书1页说明书4页附图1页(54)发明名称自然杀伤细胞的体外纯化方法(57)摘要本发明公开了一种自然杀伤细胞的体外纯化方法，包括如下步骤：提供CD3抗体溶液；将CD3抗体溶液承装在临床级培养容器内，充分反应后得到表面包被有CD3抗体的临床级培养容器；将待纯化的自然杀伤细胞混合培养物承装在包被有CD3抗体的临床级培养容器内，在常规培养条件下培养后收集上清液；对上清液进行离心并保留沉淀，洗涤沉淀得到纯化后的自然杀伤细胞。这种自然杀伤细胞的体外纯化方法利用包被有CD3抗体的临床级培养容器承载自然杀伤细胞混合培养物并培养，自然杀伤细胞混合培养物中的CD3阳性的杂细胞会与CD3抗体结合从而附着在临床级培养容器内壁，培养完成后收集临床级培养容器内的上清即可得到纯化后的自然杀伤细胞。CN106834227ACN106834227A权利要求书1/1页1.一种自然杀伤细胞的体外纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：提供CD3抗体溶液；将所述CD3抗体溶液承装在临床级培养容器内，充分反应后得到表面包被有CD3抗体的临床级培养容器；将待纯化的自然杀伤细胞混合培养物承装在所述包被有CD3抗体的临床级培养容器内，在常规培养条件下培养2h～4h后收集所述包被有CD3抗体的临床级培养容器内的上清液；以及对所述上清液进行离心并保留细胞沉淀，洗涤所述细胞沉淀得到纯化后的自然杀伤细胞。2.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的体外纯化方法，其特征在于，所述CD3抗体溶液的溶质为CD3单克隆抗体或CD3多克隆抗体；所述CD3抗体溶液的浓度为100ng/mL～400ng/mL。3.根据权利要求1或2所述的自然杀伤细胞的体外纯化方法，其特征在于，所述CD3抗体溶液的溶剂为PBS缓冲液或浓度为0.9g/100mL的NaCl溶液。4.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的体外纯化方法，其特征在于，所述临床级培养容器为培养表面未组织处理过的T175细胞培养瓶。5.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的体外纯化方法，其特征在于，所述充分反应后得到表面包被有CD3抗体的临床级培养容器的操作中，所述反应的时间为8h～24h，所述反应的温度为2℃～8℃。6.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的体外纯化方法，其特征在于，所述常规培养条件的温度为37℃、5％CO2。7.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的体外纯化方法，其特征在于，所述对所述上清液进行离心并保留细胞沉淀的操作中，所述离心的转速为600rpm～1000rpm，所述离心的时间为5min～10min。8.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的体外纯化方法，其特征在于，所述洗涤所述细胞沉淀的操作为：采用浓度为0.9g/100mL的NaCl溶液重悬所述细胞沉淀，接着600rpm～1000rpm离心5min～10min，保留洗涤干净的细胞沉淀。2CN106834227A说明书1/4页自然杀伤细胞的体外纯化方法技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种自然杀伤细胞的体外纯化方法。背景技术[0002]作为天然免疫细胞中的重要淋巴细胞组分，自然杀伤细胞(NatureKillerCell，NK细胞)担任着对肿瘤和病原体胞内感染细胞进行免疫监视的重要任务。体外扩增NK细胞是NK细胞治疗技术中一项关键技术，受到广泛关注。现有的体外扩增NK细胞技术种类多种多样，目前主要的NK细胞体外扩增技术分为饲养细胞依赖和饲养细胞非依赖的两种方式。其中饲养细胞非依赖的NK细胞体外扩增技术安全性较高，但是最终获得细胞的纯度不高，并且受到技术方法限制和供体个体差异的影响，难以达到一致的NK细胞扩增纯度。而NK细胞的纯度则直接影响到细胞治疗的效果，纯度越高疗效越好。[0003]NK细胞混合培养体系中除了NK细胞外，主要的杂细胞是CD3(ClusterDifferentiation3)阳性的细胞群体。传统的提高NK细胞纯度的方法为MACS(MagneticActivatedCellSorting)磁珠分选技术。但是MACS磁珠分选技术会在NK细胞表面结合上磁珠，不能完全去除，存在可能的临床应用隐患，因而难以大规模应用。发明内容[0004]基于此，有必要提供一种具