多肽‑抗体免疫偶联物及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106822863A(43)申请公布日2017.06.13(21)申请号201710005459.4(22)申请日2017.01.04(71)申请人国家纳米科学中心地址100190北京市海淀区中关村北一条11号(72)发明人赵颖聂广军郎佳妍季天骄齐菲菲(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人王文君(51)Int.Cl.A61K38/16(2006.01)A61K47/68(2017.01)A61P35/00(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表1页附图5页(54)发明名称多肽-抗体免疫偶联物及其制备方法(57)摘要本发明提供一种多肽-抗体免疫偶联物及其制备方法，所述免疫偶联物由多肽与抗体或抗体Fc段通过共价键连接而成，其中，所述多肽为pH敏感型穿膜肽。本发明的穿膜肽-抗体免疫偶联物既保留了穿膜肽pH响应穿膜的特点，又保留了抗体引起抗体依赖细胞介导的细胞毒(ADCC)的功能。体外实验证明，多肽-抗体免疫偶联物可实现酸响应型穿膜并将抗体或抗体Fc段蛋白锚定在细胞膜上诱发ADCC。体内实验结果表明，多肽-抗体免疫偶联物明显抑制小鼠黑色素瘤和乳腺癌的生长，可用于临床实体瘤的免疫治疗。CN106822863ACN106822863A权利要求书1/1页1.一种多肽-抗体免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物由多肽与抗体或抗体Fc段通过共价键连接而成，其中，所述多肽为pH敏感型穿膜肽。2.根据权利要求1所述的免疫偶联物，其特征在于，所述多肽的序列如下：Ac-ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT，其中，Ac为乙酰基。3.根据权利要求2所述的免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物由pH敏感型穿膜肽与抗体Fc段或抗体通过琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯共价键连接而成，即所述pH敏感型穿膜肽N端半胱氨酸残基上的巯基与抗体Fc段赖氨酸残基上的ε-氨基通过琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯共价交联而成。4.根据权利要求1-3任一项所述的免疫偶联物，其特征在于，所述抗体或抗体Fc段为可诱导ADCC的抗体或抗体片段。5.根据权利要求4所述的免疫偶联物，其特征在于，所述抗体Fc段包括小鼠IgG2a或IgG2b的Fc片段，所述抗体为人CD20抗体，优选利妥昔单抗。6.根据权利要求1-3任一项所述的免疫偶联物，其特征在于，每个抗体或抗体Fc段连接1-2条pH敏感型穿膜肽。7.权利要求3-6任一项所述免疫偶联物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、抗体Fc段与交联剂琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯在pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中室温搅拌反应0.5-1.5h，形成马来酰亚胺修饰的Fc蛋白，即Fc-SMCC；S2、将步骤S1所得产物与pH敏感型穿膜肽在pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中室温搅拌2-4h，即得所述多肽-抗体Fc段免疫偶联物。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，抗体Fc段和交联剂的摩尔比为0.025-0.5:1，pH敏感型穿膜肽与Fc-SMCC的摩尔比为0.1-1:10。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S1还包括将生成的Fc-SMCC通过SephadexG25除去未反应的交联剂，并通过截留分子量3KDa的Amiconultra超滤管对产物进行浓缩的步骤。10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S2还包括将生成的多肽-抗体Fc段免疫偶联物用截留分子量10KDa的Amiconultra超滤管除去未反应的pH敏感型穿膜肽的步骤。2CN106822863A说明书1/6页多肽-抗体免疫偶联物及其制备方法技术领域[0001]本发明涉及药物工程技术领域，具体地说，涉及一种多肽-抗体免疫偶联物及其制备方法。背景技术[0002]恶性肿瘤是仅此于心脑血管疾病的人类第二大杀手，近年来，随着治疗性单克隆抗体临床应用的逐渐增加，抗体依赖细胞介导的细胞毒(antibody-dependentcellmediatedcytotoxicity，ADCC)的抗肿瘤效果日益受到重视。抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用是指具有杀伤活性的细胞(如NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等)通过其表面表达的Fc受体(FcR)识别包被于靶抗原(如细菌或肿瘤细胞)上的Fc段，直接杀伤靶细胞。自然杀伤细胞(NK细胞)是介导ADCC特异性抗肿瘤最主要的效应细胞，而吞噬细胞、T细胞及粒细胞对ADCC抗肿瘤效应也有一定作用。ADCC被证明是单克隆抗体临床治疗肿瘤的重要机制和手段，在抗体介导的ADCC作用的发生过程中，抗体只能与靶细胞上的相应抗原表位特异性结合，而NK细胞等效应细胞可杀伤任