一种心脏全器官脱细胞基质的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107137769A(43)申请公布日2017.09.08(21)申请号201710419884.8(22)申请日2017.06.06(71)申请人中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所地址100850北京市海淀区太平路27号(72)发明人王常勇周瑾杨皛宁李红沈远(74)专利代理机构北京中誉威圣知识产权代理有限公司11279代理人叶立涛田昕(51)Int.Cl.A61L27/36(2006.01)权利要求书1页说明书3页附图2页(54)发明名称一种心脏全器官脱细胞基质的制备方法(57)摘要本发明公开了一种心脏全器官脱细胞基质的制备方法。该方法通过灌流1％SDS溶液，1％Ttiton，然后利用PBS冲洗，每天换液4-5次，共清洗72-128h。本发明设计合理的心脏全器官脱细胞体系，并对现有的心脏全器官脱细胞方法进行改进和优化，结合SDS洗涤剂、TritonX100等按照不同洗脱顺序和时间配比进行脱细胞处理，以提高灌流液在心脏器官中的洗脱效果，为后期脱细胞基质的评价以及组织工程再造中的应用奠定基础。由本方法制备而成的心脏全器官脱细胞基质可以在去除心脏组织原有驻留细胞的条件下，保留了心脏原有的二级、三级脉管结构，超微构象以及细胞外基质组分。CN107137769ACN107137769A权利要求书1/1页1.一种心脏全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：(1)首先获取动物心脏并置于含有肝素PBS溶液的玻璃器皿内，-70℃冷冻处理24h备用；(2)将上述动物心脏放入4℃冰箱中缓慢解冻完全后，将16G规格的钝性针头插入主动脉，用线绳于心脏根部结扎系住；(3)将心脏接入脱细胞灌流装置中，首先利用肝素PBS灌流5-15min，之后灌流1％SDS溶液10-15h，去离子水冲洗30min后，1％Ttiton灌流15-30min，之后利用PBS冲洗，每天换液4-5次，共清洗72-128h，上述灌流速度3mL/min；(4)灌流后经过钴6o照射灭菌处理。2.根据权利要求1所述的心脏全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述动物为鼠，人，羊，马，牛，骆驼或猪。2CN107137769A说明书1/3页一种心脏全器官脱细胞基质的制备方法技术领域[0001]本发明涉及一种脱细胞基质，特别涉及一种心脏全器官脱细胞基质的制备方法。背景技术[0002]心血管病在我国乃至全世界已成为发病率及死亡率最高的疾病之一，严重威胁人类健康。其中，终末期心脏病患病率的增加已成为心血管疾病中重要的医疗问题，而心脏的原位异体移植是当前针对其唯一有效的治疗手段。然而，心脏移植手术目前却面临着诸多挑战，如工体严重不足以及移植后免疫排斥等问题，极大限制了临床应用。[0003]心脏全器官脱细胞机制处理的目的是在尽可能清楚细胞内物质成分的情况下而更多保留细胞外基质有效成分(包括胶原、糖胺聚糖、可溶性生长因子等)。在以往研究中，尽管不断有新的脱细胞方法出现，但是由于不同脱细胞方法对细胞外基质各组分影响不尽相同，迄今为止尚且没有一种理想的脱细胞方法能够完整保持细胞外基质有效成分。[0004]物理洗脱即利用冷冻、直接冲洗、超声法和搅拌法等方法将细胞成分去除。对于较为坚韧的组织(如肌腱、韧带等)，快速冷冻法最为常用。快速冷冻可以使组织和细胞内部形成大量冰晶，从而达到迅速破坏细胞膜，使细胞溶解的目的。通过这种暴力的方法破坏细胞还不够，要彻底洗脱细胞成分，还需再利用冲洗法通过灌流液在器官脉管结构内不断地循环冲洗，方可达到目的。另外，超声和搅拌法通常会结合化学洗脱法一起进行。利用超声或搅拌首先使细胞物理破碎，再利用化学洗涤剂将破碎的细胞成分逐渐洗脱。而心脏是介于坚韧和柔软之间的器官，其脱细胞通常不会采用过于暴力的方法，以免破坏结构。[0005]可用于洗脱的化学物质种类繁多，最常见的有酸碱洗脱法、高渗-低渗溶液洗脱法和洗涤剂洗脱法。酸碱洗脱的原理均是利用化学酸/碱性环境破坏分子结构，最终达到清除细胞的目的。其中，过氧乙酸是一种薄层组织常用的酸性洗脱剂，它能够在清除核酸成分的同时较好地保留细胞外基质成分。而醋酸则会溶解胶原成分，但对GAG保留较为完整。另外，碱性洗剂(氢氧化钙、氢氧化钠、硫化钠等)作用强烈，对细胞和ECM破坏较大，多被用在真皮组织早期的毛发脱除上。高渗-低渗洗脱原理主要是利用高渗盐溶液溶解DNA，而低渗液使细胞溶解，从而清除细胞成分。在实际应用中，经常将组织在高渗-低渗液中交替浸泡而达到洗脱目的。洗涤剂是指非离子、离子和两性离子洗涤剂，包括Triton-X100、十二烷基磺酸钠(sodiumdodecylsulfonate，SDS)等。其作用温和，易于操作，是目前针对心脏最常用的洗脱法。T