一种脱细胞软骨基质及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109621010A(43)申请公布日2019.04.16(21)申请号201811544160.7(22)申请日2018.12.17(71)申请人浙江华臻医疗器械有限公司地址325000浙江省温州市高新技术产业开发区创业服务中心科技企业孵化器中试大楼东边501室B-6(自主申报)(72)发明人赵子建王建英李芳红潘璐琪冯文金史啟(74)专利代理机构北京三聚阳光知识产权代理有限公司11250代理人李静(51)Int.Cl.A61L27/36(2006.01)A61L27/50(2006.01)权利要求书2页说明书15页附图3页(54)发明名称一种脱细胞软骨基质及其制备方法(57)摘要本发明涉及关节软骨技术领域，具体涉及一种脱细胞软骨基质及其制备方法，将软骨组织依次通过低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理，制得软骨基质，本发明制备的脱细胞软骨基质能够最大限度地保留软骨细胞基质本身的三维结构，具有良好的机械性能，而且不需要外加交联剂进行物理或者化学交联，免疫原性低、毒性低，而且制备方法简单，成本较低，适宜产业化生产。CN109621010ACN109621010A权利要求书1/2页1.一种脱细胞软骨基质的制备方法，其特征在于，将软骨组织依次通过低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理，制得软骨基质。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在低渗处理中，将软骨组织加入低渗溶液中孵育，室温下孵育15-30h；优选地，所述低渗溶液为10mM且pH为7-8的Tris-Hcl溶液。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在胰蛋白酶处理中，将软骨组织加入胰蛋白酶溶液中，在37℃下水浴加热6-24h；优选地，所述胰蛋白酶溶液为含0.10-0.50％(m/v)胰蛋白酶的PBS溶液。4.根据权利要求1-3中任一所述的制备方法，其特征在于，在去污剂处理中，将软骨组织加入去污剂溶液中，在温度为15-25℃下振荡处理15-30h；优选地，所述去污剂溶液为含0.05-0.3％SDS的8-10mM的Tris-Hcl溶液。5.根据权利要求1-4中任一所述的制备方法，其特征在于，在核酸酶处理中，将软骨组织加入缓冲细胞液中，然后加入30-60U/ml的DNA酶和0.5-4U/ml的RNA酶，在35-40℃下水浴加热6-20h；优选地，所述缓冲细胞液为含5-30mM氯化镁的Tris-Hcl溶液，所述Tris-Hcl溶液的浓度为30-60mM，pH为7-8。6.根据权利要求1-5中任一所述的制备方法，其特征在于，在低渗处理之前还包括对软骨组织进行反复冻融处理；优选地，在反复冻融处理中，将软骨组织置于-70～-80℃下冷冻2-4h，然后置于15-25℃下解冻1-6h，反复冻融1-6次。7.根据权利要求1-6中任一所述的制备方法，其特征在于，在核酸酶处理之前还包括中性蛋白酶处理；优选地，在中性蛋白酶处理中，将软骨组织加入含300-700U/L的中性蛋白酶的生理盐水中，在30-40℃下水浴加热4-12h；优选地，在中性蛋白酶处理之后还包括α-1,3-半乳糖苷酶溶液处理，在α-1,3-半乳糖苷酶处理中，将软骨组织加入含10-40μg/mL的α-1,3-半乳糖苷酶的PBS溶液中，在25-37℃下，浸泡1-6小时。8.根据权利要求1-7中任一所述的制备方法，其特征在于，在核酸酶处理之后还包括灭菌处理；优选地，在灭菌处理中，将软骨组织加入消毒液中浸泡1-6h，所述消毒液为含有0.05-0.4vt％乙酸和0.05-0.4wt％次氯酸钠的PBS溶液，或含有0.05-0.4vt％乙酸和0.05-0.4vt％84消毒液的PBS溶液。9.根据权利要求1-8所述的制备方法，其特征在于，软骨组织在低渗处理之前还包括前清洗处理；在低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理之后还包括中间清洗处理；在核酸酶处理之后还包括后清洗处理；优选地，在前清洗处理中，将软骨组织加入生理盐水中浸泡，然后加入超纯水中超声清洗，再用超纯水持续冲洗；优选地，在中间清洗处理中，将软骨组织加入超纯水中超声清洗，再用超纯水持续冲洗；2CN109621010A权利要求书2/2页优选地，在后清洗处理中，将软骨组织加入无菌PBS中浸泡。10.一种权利要求1-9中任一所述的制备方法制得的脱细胞软骨基质。3CN109621010A说明书1/15页一种脱细胞软骨基质及其制备方法技术领域[0001]本发明涉及关节软骨技术领域，具体涉及一种脱细胞软骨基质及其制备方法。背景技术[0002]关节软骨是人体关节的重要结构，关节软骨的主要功能是保护骨骼关节面免受磨损。因关节软骨上无血管、淋巴和软骨分布，且软骨细胞高度分化，使得关节软骨自身修