一种酶法高效制备角膜脱细胞基质组织工程支架的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107213515A(43)申请公布日2017.09.29(21)申请号201710507222.6(22)申请日2017.06.28(71)申请人山东大学地址250199山东省济南市历城区山大南路27号(72)发明人张玉忠李悦陈秀兰石梅赵芳孙鹤敏宋晓妍(74)专利代理机构济南金迪知识产权代理有限公司37219代理人朱家富(51)Int.Cl.A61L27/36(2006.01)A61L27/50(2006.01)权利要求书1页说明书7页附图7页(54)发明名称一种酶法高效制备角膜脱细胞基质组织工程支架的方法(57)摘要一种酶法高效制备角膜脱细胞基质组织工程支架的方法，步骤如下：(1)将猪角膜基质板层置于稀释的Myroilysin中，进行脱细胞处理，然后生理盐水、蒸馏水分别冲洗，制得猪角膜脱细胞支架板层；(2)将猪角膜脱细胞支架放置在钻台上，滴加核黄素溶液，并在紫外灯下照射，然后生理盐水、蒸馏水分别冲洗，制成核黄素交联的猪角膜脱细胞支架；(3)将步骤(2)制得的交联的猪角膜脱细胞支架经脱水、灭菌，4℃保存待用。本发明制得的脱细胞支架仍保留足够的机械强度，并且形成了一定的孔隙，脱水后透明度较高，有利于细胞的生长和迁移。CN107213515ACN107213515A权利要求书1/1页1.一种酶法高效制备角膜脱细胞基质组织工程支架的方法，其特征在于，步骤如下：(1)将猪角膜基质板层置于稀释的Myroilysin中，在35～38℃条件下进行脱细胞处理10～18h，然后生理盐水、蒸馏水分别冲洗，制得猪角膜脱细胞支架板层；(2)将步骤(1)制备的将猪角膜脱细胞支架放置在钻台上，滴加核黄素溶液20～40min，并在波长为365nm的紫外灯下照射30～60min，然后生理盐水、蒸馏水分别冲洗，制成核黄素交联的猪角膜脱细胞支架；(3)将步骤(2)制得的交联的猪角膜脱细胞支架经脱水、灭菌，4℃保存待用。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的Myroilysin酶溶液，采用如下方法制备：(i)将经过活化的深海细菌(Myroidesprofundi)D25菌株接种于液体发酵培养基中，14～16℃发酵培养70～75h；将发酵液离心取上清液，向上清液中加入硫酸铵至硫酸铵饱和度为60％，收集沉淀，经Tris-HCl重悬、透析后离心，再经离子交换层析分离纯化，G75分子筛分离纯化，制得弹性蛋白酶Myroilysin粗酶液；(ii)将步骤(i)制得的弹性蛋白酶Myroilysin粗酶液经截留分子量为10000Da的超滤管超滤浓缩，制得浓缩液，然后添加质量百分比15％的甘油，分装保存在-80℃，即得。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(i)中，离子交换层析为用DEAE阴离子柱通过0～0.8M的NaCl梯度洗脱分离纯化。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(ii)中，浓缩液中Myroilysin酶的浓度为1.8～2.2mg/ml。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，稀释的Myroilysin酶溶液为用pH9.0的50mMTris-HCl缓冲液稀释Myroilysin酶溶液，制得甘油体积百分比占18～22％、Myroilysin酶质量浓度为100～1000μg/ml的Myroilysin酶溶液。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，Myroilysin酶质量浓度为100μg/ml的Myroilysin酶溶液在37℃下处理18h；Myroilysin酶质量浓度为300μg/ml的Myroilysin酶溶液在37℃下处理16h；Myroilysin酶质量浓度为500μg/ml的Myroilysin酶溶液在37℃下处理16h；Myroilysin酶质量浓度为800μg/ml的Myroilysin酶溶液在37℃下处理10h；Myroilysin酶质量浓度为1000μg/ml的Myroilysin酶溶液在37℃下处理10h。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，猪角膜基质板层与稀释的Myroilysin酶溶液的质量体积比为1：20～30；优选的，所述步骤(1)中，处理为在转速为80rpm的条件下震荡处理。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，核黄素溶液的浓度为1mg/ml。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，脱水为在无菌甘油中脱水22～28h。10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，灭菌为在20K的条件下辐照灭菌。2CN107213515A说明书1/7页一种酶法高效制备角膜脱细胞基质组织工程支架的方法技术领域[0001]本发明涉及