一种贴壁细胞冻存液、冻存方法和解冻方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108552158A(43)申请公布日2018.09.21(21)申请号201810323244.1(22)申请日2018.04.09(71)申请人广东省中医院（广州中医药大学第二附属医院、广州中医药大学第二临床医学院、广东省中医药科学院）地址510120广东省广州市越秀区大德路111号(72)发明人秦笙郑水兰周强柯培锋陈茶蓝锴张文黄宪章(74)专利代理机构广州三环专利商标代理有限公司44202代理人麦小婵郝传鑫(51)Int.Cl.A01N1/02(2006.01)权利要求书1页说明书7页附图2页(54)发明名称一种贴壁细胞冻存液、冻存方法和解冻方法(57)摘要本发明公开了一种贴壁细胞冻存液，包括DMSO、1，2-丙二醇、聚乙二醇、BSA和DMEM培养基；本发明还公开了一种贴壁细胞的冻存方法，包括步骤：向贴壁细胞加入所述冻存液，混匀后冻存；以及一种贴壁细胞的解冻方法，包括步骤：(1)取冻存的贴壁细胞，经水浴加热解冻；(2)除去步骤(1)所得贴壁细胞中的冻存液，并用PBS溶液清洗以去除贴壁细胞中残留的冻存液，即得解冻后的贴壁细胞。采用本发明的冻存液处理的贴壁细胞冻存后可在低温状态下长期保存，按需取用，仅通过简单的复苏程序(不超过10分钟)即可使用；细胞贴壁冻存后可直接进行低温运输，为无细胞培养条件的实验室提供方便、即时可用的细胞。CN108552158ACN108552158A权利要求书1/1页1.一种贴壁细胞冻存液，其特征在于，包括DMSO、丙二醇、聚乙二醇、BSA和DMEM培养基。2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液由下述浓度的成分组成：体积百分比为15～25％的DMSO、体积百分比为12.5～26％的1，2-丙二醇、体积百分比为1.2～5％的聚乙二醇和0.08～0.15g/mL的BSA，余量为DMEM培养基。3.根据权利要求2所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液由下述浓度的成分组成：体积百分比为15％的DMSO、体积百分比为26％的1，2-丙二醇、体积百分比为1.2％的聚乙二醇和0.15g/mL的BSA，余量为DMEM培养基。4.根据权利要求2所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液由下述浓度的成分组成：体积百分比为25％的DMSO、体积百分比为12.5％的1，2-丙二醇、体积百分比为5％的聚乙二醇和0.08g/mL的BSA，余量为DMEM培养基。5.根据权利要求2所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液由下述浓度的成分组成：体积百分比为20％的DMSO、体积百分比为20％的1，2-丙二醇、体积百分比为2.5％的聚乙二醇和0.1g/mL的BSA，余量为DMEM培养基。6.一种贴壁细胞的冻存方法，其特征在于，包括步骤：向所述贴壁细胞加入权利要求1～5任一项所述的冻存液，混匀后冻存。7.根据权利要求6所述的冻存方法，其特征在于，包括步骤：所述贴壁细胞与冻存液混匀后，先经4℃冷藏0.5～2h，然后在-20℃储存1～4h，最后转入-80℃冷柜保存。8.根据权利要求7所述的冻存方法，其特征在于，所述冷藏时间为1h，-20℃储存时间为2h。9.一种贴壁细胞的解冻方法，其特征在于，包括步骤：(1)取权利要求6～8任一项所述的冻存后的贴壁细胞，经水浴加热解冻；(2)除去步骤(1)所得贴壁细胞中的冻存液，并用PBS溶液清洗以去除贴壁细胞中残留的冻存液，即得解冻后的贴壁细胞。10.根据权利要求9所述的解冻方法，其特征在于，所述水浴的温度为40℃，所述水浴的时间为3～10分钟，所述贴壁细胞为MDCK细胞、LLC-MK2细胞或HEP-2细胞。2CN108552158A说明书1/7页一种贴壁细胞冻存液、冻存方法和解冻方法技术领域[0001]本发明涉及细胞保存技术领域，尤其是一种贴壁细胞冻存液、冻存方法和解冻方法。背景技术[0002]细胞在培养过程中，按照生长方式分为贴壁生长和悬浮生长两种，其中大部分细胞是贴壁生长的。贴壁培养的细胞的传统冷冻方法一般是先将贴壁的细胞消化下来，然后收集细胞消化液并离心，之后去除上清加入冷冻液，将细胞完全包裹在冷冻液中，放入冻存管中逐步降温，最后放入液氮中长期保存。这种方法用于种质细胞资源的长期保存非常成功，保存时间可长达十几、甚至二十几年，细胞解冻后依然有活力。但是这种方法只能用于保存细胞株，细胞使用前需时进行细胞复苏，不能满足随用随取的要求。[0003]超低温保存是将生物标本冷冻至-80℃～-196℃的低温，利用细胞内新陈代谢减慢乃至停止的特性，从而实现较长时间的保存。超低温保存过程具有几个关键性环节：低温保护剂的选择与加入、冷冻方案、保存温度以及复温过程。[0004]低温保护剂是细胞低温保存必不可少的添加剂，主要用于抑制细胞内