细胞冻存液和细胞冻存方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107494521A(43)申请公布日2017.12.22(21)申请号201710932562.3(22)申请日2017.10.09(71)申请人天津长和生物技术有限公司地址301900天津市蓟县盘山南路南侧许家台村东侧(72)发明人牟春琳杨治权李伟(74)专利代理机构北京超凡志成知识产权代理事务所(普通合伙)11371代理人吴开磊(51)Int.Cl.A01N1/02(2006.01)权利要求书1页说明书9页附图8页(54)发明名称细胞冻存液和细胞冻存方法(57)摘要本发明提供了一种细胞冻存液和细胞冻存方法，涉及细胞技术领域，本发明提供的细胞冻存液，成分包括甲基纤维素、糖类、氨基酸和DMSO。本发明提供的细胞冻存液，不含有胎牛血清成分，从而彻底杜绝了过敏反应，以及一些动物病毒的污染引入；同时，降低了DMSO的含量，从而降低了冻存液的毒性对细胞的影响。另外，本发明提供的细胞冻存方法，利用梯度降温，提高冻存后细胞复苏的活率。经过实验验证，在细胞形态、增值率、诱导分化潜能等细胞主要考察内容，本发明提供的冻存液与冻存方法均优于传统冻存液及传统冻存方法。CN107494521ACN107494521A权利要求书1/1页1.一种细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液包括：甲基纤维素、糖类、氨基酸和DMSO。2.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液主要由以下组分组成：甲基纤维素0.1-2.0％(w/v)，糖类0.5-3.0％(w/v)，氨基酸0.5-3.0％(w/v)，DMSO2-8％(v/v)，PBS溶剂。3.根据权利要求2所述的细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液由以下组分组成：甲基纤维素0.2-1.0％(w/v)，糖类1.0-2.0％(w/v)，氨基酸1.0-2.0％(w/v)，DMSO4-6％(v/v)，PBS溶剂；优选地，所述细胞冻存液由以下组分组成：甲基纤维素0.5％(w/v)，糖类1.5％(w/v)，氨基酸1.5％(w/v)，DMSO5％(v/v)，PBS溶剂。4.根据权利要求1-3任一项所述的细胞冻存液，其特征在于，所述糖类包括麦芽糖或葡糖糖中的至少一种。5.根据权利要求4所述的细胞冻存液，其特征在于，所述氨基酸包括脯氨酸或谷氨酰胺中的至少一种。6.根据权利要求5所述的细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液主要由以下组分组成：甲基纤维素0.1-2.0％(w/v)，麦芽糖0.1-1.0％(w/v)，葡萄糖0.4-2.0％(w/v)，脯氨酸0.4-2.0％(w/v)，谷氨酰胺0.1-1.0％(w/v)，DMSO2-8％(v/v)，PBS溶剂。7.根据权利要求6所述的细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液由以下组分组成：甲基纤维素0.2-1.0％(w/v)，麦芽糖0.2-0.8％(w/v)，葡萄糖0.5-1.5％(w/v)，脯氨酸0.5-1.5％(w/v)，谷氨酰胺0.2-0.8％(w/v)，DMSO4-6％(v/v)，PBS溶剂；优选地，所述细胞冻存液由以下组分组成：甲基纤维素0.5％(w/v)，麦芽糖0.5％(w/v)，葡萄糖1.0％(w/v)，脯氨酸1.0％(w/v)，谷氨酰胺0.5％(w/v)，DMSO5％(v/v)，PBS溶剂。8.一种细胞冻存方法，其特征在于，所述细胞冻存方法包括：调整细胞密度后，梯度降温至-80℃，放置20-30小时后移入液氮保存。9.根据权利要求8所述的细胞冻存方法，其特征在于，所述细胞密度为5×105个/mL-5×106个/mL。10.根据权利要求8所述的细胞冻存方法，其特征在于，所述梯度降温的降温速率为5-15℃/min。2CN107494521A说明书1/9页细胞冻存液和细胞冻存方法技术领域[0001]本发明涉及细胞技术领域，尤其是涉及一种细胞冻存液和细胞冻存方法。背景技术[0002]间充质干细胞来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点，这意味着其在临床治疗和再生医学领域的应用前景十分广阔。[0003]间充质干细胞的应用，对细胞数量需求较大，而其直接获取量较小，所以须在获取后进行体外扩增培养。而细胞扩增培养到一定数量后会失去部分功能特性，所以，为了保证细胞的有效性和一致性，体外培养进行到一定阶段时，必须进行低温保存(液氮，-196℃)。[0004]在不加保护条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成冰晶，能导致细胞内发生一系列的变化，如机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH值改变、蛋白质变性等，能引起细胞死亡。向冻存液中加入保护剂(一般为DMSO),可使冰点降低，在缓慢的冻存条件下，能使细胞内水分在冻结前透