一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112048471A(43)申请公布日2020.12.08(21)申请号202010993731.6(22)申请日2020.09.21(71)申请人淄博市中心医院地址255022山东省淄博市张店区共青团西路54号(72)发明人翟俏丽王连庆郑林林(74)专利代理机构天津铂茂专利代理事务所(普通合伙)12241代理人陈晓蕾(51)Int.Cl.C12N5/0775(2010.01)权利要求书1页说明书4页(54)发明名称一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法(57)摘要本发明公开了一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下制备步骤：S1：使用无血清的条件培养基，将培养骨髓间充质干细胞放入到培养基中12小时，然后在培养基中加入5ug促产量试剂，然后继续培养24小时；S2:离心去除细胞，收集上清液粗品后，再离心后，过滤，除去残留的细胞及细胞碎片后，制得含有外泌体的上清液；S3：将S2中的待提取外泌体的溶液，在加入乙二醇聚氧乙烯醚和葡聚糖后。本发明提供的提取外泌体的方法，大大地提高了外泌体的产量，在提高产量的同时，通过两次重悬处理后，得到的骨髓间充质干细胞外泌体纯度和产量都很高。CN112048471ACN112048471A权利要求书1/1页1.一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：S1：使用无血清的条件培养基，将培养骨髓间充质干细胞放入到培养基中12-18小时，然后在培养基中加入5ug促产量试剂，然后继续培养24-36小时；S2:离心去除细胞，收集上清液粗品后，再离心后，过滤，除去残留的细胞及细胞碎片后，制得含有外泌体的上清液；S3：将S2中的待提取外泌体的溶液，在加入乙二醇聚氧乙烯醚和葡聚糖后，将所述溶液置于1-9°C条件下反应35-85min；S4：将S3中的溶液离心去除细胞，收集上清液粗品后，再离心后，过滤，取沉淀，收集沉淀重悬于重悬试剂中，中得预重悬液；S5：将S4中的预重悬液，加入乙二醇聚氧乙烯醚和葡聚糖后，将所述预重悬液置于0-5°C条件下反应30-65min；S6：然后将S5中的预重悬液再一次去除细胞，收集上清液粗品后，再离心后，过滤，取沉淀，收集沉淀重悬于重悬试剂中，得重悬液，即为纯化后的外泌体。2.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述离心的条件如下：5500g，离心10分钟。3.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述重悬试剂为磷酸缓冲液。4.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述乙二醇聚氧乙烯醚的浓度为18w/v％，葡聚糖的浓度为24mg/mL。5.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述葡聚糖中加入有氯化钠。6.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述S1中的培养环境为温度为36-37°C、氧体积浓度0.5％，CO体积浓度5％的混合气体。7.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述S1中使用无血清的条件培养基为加入丙酮酸钠110mg/L和谷氨酰胺10-30mM的低糖DMEM培养基。8.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述S1中加入的促产量试剂为VCAM1试剂。2CN112048471A说明书1/4页一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法技术领域[0001]本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法。背景技术[0002]肝癌是一种常见的恶性肿瘤，可分为原发性和继发性两大类，原发性肝癌起源于肝脏上皮或间叶组织；继发性或称转移性肝癌系指全身多个器官起源的恶性肿瘤侵犯至肝脏。无论是新生病例的产生还是死亡人数，发展中国家罹患肝癌的人数都要远远多于发达国家，且在全球范围内男性的发病人数和死亡人数均多于女性。[0003]同时研究证实，乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)是导致肝癌发生的主要病原体，HBV感染引起的肝癌占所有肝癌病例的80％左右。虽然医学技术在不断进步，然而我国肝癌的早期诊断率仅为20％左右，肝癌患者治疗后5年生存率不足10％。[0004]外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的30-150nm的小囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体内陷形成的多囊泡体，并经多囊泡体与细胞膜融合分泌到细胞外基质中[22]。大量研究表明，外泌体是细胞间通讯的重要调节因子，在机体免疫应答、抗原呈递、细胞迁移、分化以及肿瘤侵袭等方面均具有重要调控作用。外泌体来源丰富，易于改造，携带的物质容易被细胞摄取，可以避免