一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112342190A(43)申请公布日2021.02.09(21)申请号201910662886.9(22)申请日2019.07.22(71)申请人陈传果地址518102广东省深圳市宝安区西乡流塘新村东10号(72)发明人陈传果(51)Int.Cl.C12N5/0775(2010.01)C12N11/10(2006.01)C12N11/096(2020.01)C12N11/04(2006.01)A61K35/28(2015.01)A61P19/08(2006.01)A61P17/00(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图4页(54)发明名称一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用(57)摘要本发明提供一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用，使用微囊作为间充质干细胞的生长体系，在三维条件下培养间充质干细胞，培养环境更接近体内，有利于提高间充质干细胞分泌的外泌体产量。微囊的半透膜可以有效截留外泌体，提高微囊内外泌体浓度，为下游的分离纯化节省工艺成本及时间；也可以避免培养基血清来源的外泌体进入微囊内，避免使用特定的商品化无血清培养基，降低培养成本。本发明提供的三维培养提高间充质干细胞外泌体产量的方法，有望解决解决外泌体产量不足的技术瓶颈。CN112342190ACN112342190A权利要求书1/1页1.一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用，其特征在于，实现此发明主要包括以下步骤：（1）分离间充质干细胞；（2）微囊化包埋间充质干细胞；（3）在培养瓶（皿）或生物反应器中，微囊化培养间充质细胞；（4）收获外泌体；（5）外泌体分离纯化；（6）外泌体的鉴定和检测；（7）外泌体的临床应用。2.根据权利要求1所述的提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用，其特征在于，所述间充质干细胞包括脐带、骨髓、脂肪来源的间充质干细胞。3.根据权利要求1所述的提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用，其特征在于，所述微囊制备材料包括但不限定于但不限定于海藻酸钠、α-聚赖氨酸、壳聚糖、二价氯化盐。4.根据权利要求1所述的提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用，其特征在于，所述的微囊粒径在200-500μm。5.根据权利要求1所述的提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用，其特征在于，所述的微囊膜可以截留外泌体在囊内，提高微囊内外泌体浓度，为下游的分离纯化节省工艺成本及时间。6.根据权利要求1所述的提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用，其特征在于，所述的微囊膜可以避免培养基血清来源的外泌体进入微囊内，避免使用特定的商品化无血清培养基，降低培养成本。7.根据权利要求1所述的提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用，其特征在于，临床应用包括但不限于关节软骨损伤、皮肤损伤等慢性损伤性疾病。2CN112342190A说明书1/4页一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种提高间充质干细胞的外泌体产量的方法及其应用。背景技术[0002]外泌体是由细胞分泌的直径为30-150nm的小囊泡，内含来源于细胞相关的蛋白质与核苷酸等生物分子，在细胞交流间起重要作用。近期研究发现，干细胞来源的外泌体可以有效转运mRNA、microRNA及蛋白质等生物活性物质，具有减少细胞凋亡、减轻炎症反应、促进血管生成、抑制纤维化、提高组织修复潜力等重要生物学功能，在调控组织再生方面存在良好的临床应用前景。在多种疾病/损伤模型中，间充质干细胞源性外泌体干预后已被证明可恢复组织功能，在体外试验中也有类似效果，主要由细胞外囊泡miRNAs介导，胞外囊泡具有脂质双层结构，容易穿透细胞膜，不易引起免疫反应，并且可防止内部RNA和蛋白质降解。因为外泌体不含DNA成分，避免不同个体间遗传信息传递带来的风险，与细胞治疗相比，间充质干细胞源性外泌体的非细胞疗法更安全、易操作，有巨大的潜力。[0003]目前大多通过平面培养间充质干细胞获得外泌体，外泌体的低产量阻碍了其临床应用。同时，外泌体的分离纯化效率较低，也提高了外泌体的生产成本。[0004]因此，本领域亟待开发细胞培养方法增加外泌体产量以推进外泌体技术的临床应用。[0005]发明内容[0006]本发明的目的是提供一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法，解决外泌体产量不足的技术瓶颈。[0007]本发明的技术方案是这样实现的：1.分离间充质干细胞。从人来源的脐带、脂肪、骨髓中分离得到间充质干细胞，加入10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养，细胞接种密度为1-5×105cells/cm2，三天后清洗掉未贴壁细胞，当间充质干细胞融合度达到80-90%，加入0.05%的胰酶消化，按1:3比例进行传代培养。[