一种外泌体分离纯化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113444682A(43)申请公布日2021.09.28(21)申请号202111000462.X(22)申请日2021.08.30(71)申请人天九再生医学（天津）科技有限公司地址300301天津市滨海新区滨海科技园康泰大道59号(72)发明人葛啸虎王淼陆路杜焕青韩春乐(74)专利代理机构天津诺德知识产权代理事务所(特殊普通合伙)12213代理人栾志超王旭(51)Int.Cl.C12N5/071(2010.01)权利要求书1页说明书11页附图9页(54)发明名称一种外泌体分离纯化方法(57)摘要本发明涉及一种外泌体分离纯化方法，取含有外泌体的体液或培养液，经过阴离子交换层析和/或分子筛层析后获得纯化后的外泌体溶液。通过这样的提纯方法即便在大规模的外泌体需求中，也能够低成本、高效率的获得高纯度的外泌体；与现有的外泌体纯化方法如离心法、PEG多聚物沉淀法、亲和层析法、超滤法、分子筛尺寸排阻色谱法相比，本发明可以实现不同体积（100ml至500L）外泌体纯化，尤其杂质蛋白较多的乳源制品，也可获得纯度99%以上的乳源外泌体，同时具有低成本及高回收率的优势，能满足工业化生产的需求。CN113444682ACN113444682A权利要求书1/1页1.一种外泌体分离纯化方法，其特征在于：取含有外泌体的体液或培养液，3000g‑8000g离心，去除沉淀蛋白后进行深层过滤，再流穿阴离子交换层析和/或分子筛层析后获得纯化后的外泌体溶液。2.根据权利要求1所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：进行阴离子交换层析和/或分子筛层析前预先进行超滤。3.根据权利要求1所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：所述阴离子交换层析填料的配基为强阴离子交换配基或弱阴离子交换配基。4.根据权利要求3所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：阴离子交换配基为季铵基、二乙氨基乙基、二乙氨基丙基中的一种或几种的组合，填料粒径范围为15‑300μm，孔径范围为20‑150nm。5.根据权利要求1‑4中任一所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：含有外泌体的体液为乳源样品时，预先对样品进行杂质去除处理；杂质去除处理为酸沉淀、凝乳酶处理和盐析处理中的一种或多种的组合。6.根据权利要求5所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：所述杂质去除处理为去除杂质蛋白和/或脂肪球，其中杂质蛋白为酪蛋白及其他等电点为pH4.0‑5.5的杂蛋白。7.根据权利要求5所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：具体步骤如下：对乳源样品进行杂质去除处理，去除杂质后得到外泌体粗提液；将外泌体粗提液通过超滤膜包或中空纤维柱进行超滤浓缩换液；对浓缩后的外泌体粗提液进行阴离子交换层析，获得的流穿液为外泌体溶液；将外泌体溶液通过超滤膜包或中空纤维柱进行超滤浓缩换液；对浓缩后的外泌体溶液进行分子筛层析，取外水峰范围流穿液即为纯化后的外泌体溶液。8.根据权利要求7所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：先进行阴离子交换层析再进行分子筛层析；或者，先进行分子筛层析，再进行阴离子交换层析。9.根据权利要求7所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：通过离心后取上清和/或过滤器除蛋白的方法去除沉淀蛋白。10.根据权利要求6‑9中任一所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：乳源样品为生乳样品、脱脂乳样品或巴氏消毒乳样品。2CN113444682A说明书1/11页一种外泌体分离纯化方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种外泌体分离纯化方法。背景技术[0002]外泌体是由活细胞分泌的直径约为30‑200nm的小囊泡，具有典型的脂质双分子层结构及茶托型结构，主要分泌于细胞培养上清液、乳汁、血清、血浆、唾液、尿液、羊水及植物组织中；外泌体携带有多种蛋白质、脂类、RNA等重要信息，不仅在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用，更有望成为多种治疗药物的载体及一些疾病的早期诊断标志物。[0003]牛奶外泌体是进化上保守的独特微泡类别，其在穿过胃和胃肠道途中保持其内含的核酸和蛋白质的完整性，它们可以在局部发挥作用或被运送到循环系统中。此外，牛奶外泌体比其他天然存在的外泌体更稳定，其在酸性条件下或其他恶劣条件下表现出比其他来源的外泌体更高的稳定性，同时作为外泌体它具有低免疫原性及高度的血闹屏障通透性。牛奶外泌体的这种特性可用来实现蛋白质、多肽、核酸、小分子化学物等药物的载体，并可通过口服给药增加药物的耐受性。[0004]目前外泌体制备方法主要由以下几种方法：一是离心法，主要通过增加离心力逐级沉降或使用特定的介质根据外泌体自身密度使其悬浮于特定的位置，从而达到外泌体的分离、纯化的目的。离心法目前是提取分离外泌体最常用的方法，被认为是分离外泌体的“金标准”，其优