一种TIGIT人源化小鼠模型的构建方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109486860A(43)申请公布日2019.03.19(21)申请号201811471117.2A01K67/027(2006.01)(22)申请日2018.12.04(71)申请人江苏集萃药康生物科技有限公司地址210032江苏省南京市浦口高新技术产业开发区学府路12号(72)发明人赵静琚存祥杨笑柳张明坤侯欢欢高翔(74)专利代理机构苏州慧通知识产权代理事务所(普通合伙)32239代理人丁秀华(51)Int.Cl.C12N15/85(2006.01)C12N15/113(2010.01)C12N15/12(2006.01)C12N15/90(2006.01)权利要求书1页说明书19页序列表6页附图9页(54)发明名称一种TIGIT人源化小鼠模型的构建方法及其应用(57)摘要本发明提供了一种制备TIGIT人源化小鼠模型的方法，该方法利用CRISPR/Cas9技术，将小鼠TIGIT胞外区以及胞外区基因序列的内含子部分人源化，小鼠跨膜区和胞内区中包括内含子及UTR在内的所有序列仍为鼠源，该方式保留了基因的内部调控序列，以及完整的胞内信号传导能力，应用该方法构建的人源化模型，实现了TIGIT原有内源表达特性，满足了人源区域(抗体结合域)最大化，避免错过有效的抗体，可用于筛选和评价针对人类TIGIT基因的药物，是非常理想的临床前药物测试模型。CN109486860ACN109486860A权利要求书1/1页1.一种采用CRISPR/Cas9技术制备TIGIT人源化小鼠模型的方法，其特征在于，所述人源化小鼠中，小鼠TIGIT基因的全部胞外区域被替换为人源TIGIT的基因的对应片段，保留小鼠TIGIT跨膜区及胞内区。2.如权利要求1所述的方法，其包括以下步骤：(1)构建表达针对小鼠TIGIT基因的sgRNA的质粒；(2)构建人源化TIGIT基因的表达载体；(3)将步骤(1)所述质粒体外转录获得的sgRNA与步骤(2)的载体以及Cas9mRNA或Cas9蛋白注射至鼠受精卵细胞质或细胞核中，移植入受体母鼠生产TIGIT基因修饰人源化鼠模型；所述载体能够将鼠源TIGIT基因的胞外区替换为人源TIGIT基因的胞外区，保留了小鼠TIGIT基因的跨膜区及胞内区。3.如权利要求2所述的方法，其中所述人源化TIGIT基因包含核酸序列SEQIDNO：1。4.如权利要求2所述的方法，其中所述人源化TIGIT基因编码的嵌合蛋白序列为SEQIDNO：2。5.如权利要求1或2所述的方法，其中针对鼠源TIGIT基因的sgRNA的序列如SEQIDNO：3和SEQIDNO:4所示。6.如权利要求2-5任一项所述的方法，其中步骤(2)中构建载体的过程如下：使用小鼠C57BL/6基因组分别扩增小鼠TIGIT基因外显子1端的同源臂片段和外显子3端的同源臂片段，以HumanTIGIT的BAC为模板，扩增人源替换片段，将上述片段融合，然后连接到PMD18T载体上，构建人源化TIGIT基因的载体。7.如权利要求6所述的方法，扩增小鼠TIGIT基因外显子1端的同源臂使用的引物为SEQIDNO:5和SEQIDNO:6，扩增小鼠TIGIT基因外显子3端的同源臂使用的引物为SEQIDNO:7和SEQIDNO:8，扩增人源替换片段使用的引物为SEQIDNO:9和SEQIDNO:10引物对以及SEQIDNO：11和SEQIDNO：12引物对。8.如权利要求7所述的方法，进一步包括利用引物鉴定所述动物模型的基因型的步骤。9.一种制备TIGIT/PD1双人源化小鼠动物模型的方法，包括如下步骤：(a)利用权利要求1-8任一项所述方法获得TIGIT基因人源化小鼠；(b)将步骤(a)获得的人源化小鼠与PD1人源化小鼠交配并进行筛选，得到双人源化小鼠模型。10.权利要求1-9任一项所述的方法在评估靶向TIGIT的药物有效性、TIGIT靶向药物筛选开发、TIGIT靶向药物联合其他药物抗肿瘤药效评价、或TIGIT靶向药物的毒理研究中的应用。11.特异性靶向小鼠TIGIT基因的sgRNA，其序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。2CN109486860A说明书1/19页一种TIGIT人源化小鼠模型的构建方法及其应用技术领域[0001]本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及基于基因编辑技术的TIGIT基因修饰人源化动物模型的构建方法。背景技术[0002]近几年肿瘤免疫治疗快速发展，已然成为肿瘤治疗的第四代常规治疗方法。肿瘤免疫治疗的思路主要从靶标肿瘤细胞和活化免疫细胞两方面进行。活化免疫细胞的治疗主要有4类：肿瘤疫苗、非特异性细胞因子治疗、细胞治疗以及免疫检查点抑制剂。其中，免疫检查点抑制剂是肿瘤治疗新