一种CD27人源化小鼠模型的构建方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111019972A(43)申请公布日2020.04.17(21)申请号201911396010.0A61K49/00(2006.01)(22)申请日2019.12.30(71)申请人江苏集萃药康生物科技有限公司地址210032江苏省南京市浦口高新技术产业开发区学府路12号(72)发明人琚存祥赵静吴丹张明坤王鼎玉侯欢欢高翔(74)专利代理机构北京天盾知识产权代理有限公司11421代理人解敬文施艳荣(51)Int.Cl.C12N15/85(2006.01)C12N15/90(2006.01)C07K19/00(2006.01)A01K67/027(2006.01)权利要求书2页说明书8页附图2页(54)发明名称一种CD27人源化小鼠模型的构建方法及其应用(57)摘要本发明提供了一种制备CD27基因人源化动物的方法，该方法通过同源重组将动物来源的CD27基因编码的胞外替换为人源CD27基因编码的胞外区，保留动物来源CD27基因的胞内区，该方法成功构建了人源化CD27动物模型，该模型能够用于CD27靶向药物或评价CD27靶向药物和其他药物联用的疗效评价。CN111019972ACN111019972A权利要求书1/2页1.一种制备CD27基因人源化动物的方法，其特征在于，包括将动物来源的CD27基因编码的胞外替换为人源CD27基因编码的胞外区，保留动物来源CD27基因的胞内区，所述人源CD27基因编码的胞外区氨基酸序列如SEQIDNo：1所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：利用同源重组将人源CD27基因编码的胞外区替换动物源CD27基因编码的胞外区，打靶成功的CD27嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo：2所示。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于该方法具体包括如下步骤：1)打靶载体的构建：利用同源重组原理进行打靶载体设计，所述打靶载体包含a)与待改变的动物源基因区5’端同源的DNA片段，即5’同源臂，b)插入的人源DNA序列；和c)与待改变的动物源基因区3’端同源的第二个DNA片段，即3’同源臂；2)将打靶载体转染到ES细胞，筛选阳性克隆注射到囊胚，移植到受体动物；3)从移植受体生产CD27基因人源化动物。4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(1)中所述5’同源臂的长度4992bp，序列如SEQIDNO：3所示；所述3’同源臂长度4996bp，序列如SEQIDNO：4所示。5.根据权利要求3所述的方法，其中所述打靶载体包含SEQIDNO：5所示的序列。6.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(2)具体包括如下步骤：i.电转细胞准备：液氮中取动物的ES细胞，复苏换液，经过第2次传代后，于传代后第二天进行打靶载体的电转，电转后的细胞铺到含有相应抗性的饲养层细胞上；ii.阳性克隆的筛选鉴定：通过载体上携带的抗性标签进行筛选，挑取药筛单克隆进行基因型鉴定，检测通过的克隆安排囊胚注射；iii.阳性克隆的囊胚注射：a.将鉴定正确的阳性ES细胞克隆消化成单细胞送至注射组；b.注射用囊胚准备：挑选合适周龄雌性动物进行注射PMSG、HCG的超级排卵操作，并于注射HCG后当天下午与单放雄性动物合笼，取见栓2.5天雌性动物的输卵管及子宫，将8细胞期的胚胎挑选出来，清洗干净后转移到提前制备好的培养皿内，放入37℃、5％CO2培养箱培养过夜；c.注射：在注射当天，用注射针挑选一些小而亮且边缘比较光滑的ES细胞10-15个，选择高质量的囊胚来注射；用注射针转动胚胎，寻找细胞间隙处进针，注射针进入囊腔后轻轻将ES细胞吹入囊腔，将注射ES细胞的囊胚移入培养基培养，恢复3-4小时；d.胚胎移植：见栓2.5天受体动物称重、腹腔注射麻醉剂；待其进入深度麻醉后，剔除脊柱中下缘2cm处的毛发并消毒，借用手术器械，将输卵管暴露于体腔外，并在输卵管的膨大部前端开一个小口，将吸取已注射样品的胚胎的移植管插入开口处，轻轻吹入胚胎，保证胚胎吹入输卵管膨大部。将子宫、输卵管、卵巢等放回体腔，缝合线缝合肌肉层；创口夹缝合皮肤层，70％酒精消毒伤口处皮肤；将做完移植手术的动物放在干净笼内，37℃热台上保温直到苏醒，苏醒后转移入相应的动物饲养房，等待生仔。7.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(3)具体包括：1)后代繁育；2)鉴定：建系过程中产生的所有后代均进行基因型鉴定，以保证基因的遗传稳定性。8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：包括对出生的F1代基因型鉴定：对获得的2CN111019972A权利要求书2/2页F1代的基因组DNA分别使用两对引物进行中靶后的两端PCR鉴定，其中一对引物分别位于5’同源臂外及打靶载体的人源片段内，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标载体在小鼠基因组5’