一种TIM3人源化小鼠模型的构建方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110499328A(43)申请公布日2019.11.26(21)申请号201910639039.0(22)申请日2019.07.16(71)申请人江苏集萃药康生物科技有限公司地址210032江苏省南京市浦口区江北新区学府路12号(72)发明人高翔琚存祥赵静吴丹张明坤侯欢欢(74)专利代理机构南京艾普利德知识产权代理事务所(特殊普通合伙)32297代理人张铂(51)Int.Cl.C12N15/85(2006.01)A01K67/027(2006.01)A61K49/00(2006.01)权利要求书1页说明书8页序列表17页附图6页(54)发明名称一种TIM3人源化小鼠模型的构建方法及其应用(57)摘要本发明基于利用基因修饰的技术提供了一种TIM3人源化动物的制备方法，在免疫系统健全的小鼠上，将鼠源Havcr2基因编码的胞外区和跨膜区替换为人源HAVCR2基因编码的胞外区和跨膜区，保留小鼠Havcr2基因的胞内区，构建能与抗人源TIM3单抗相互作用的小鼠模型。该模型与普通小鼠相比，实现了关键靶分子的人源化改造，并且保留了完整的免疫系统，可用于筛选和评价针对人类基因的药物，是非常理想的临床前药物测试模型。CN110499328ACN110499328A权利要求书1/1页1.一种TIM3人源化动物细胞的构建方法，其特征在于利用基因编辑技术，将鼠源Havcr2基因编码的胞外区和跨膜区替换为人源HAVCR2基因编码的胞外区和跨膜区，保留小鼠Havcr2基因的胞内区，所述人源HAVCR2基因编码的胞外区和跨膜区氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，所述鼠源Havcr2基因编码的胞外区和跨膜区氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述基因编辑技术为ES细胞打靶技术。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于包括如下步骤：(1)选择鼠源Havcr2基因胞外和跨膜区两端作为打靶位点，以鼠源Havcr2基因非替换区作为同源臂，利用同源重组原理设计包含人源HAVCR2基因胞外区的打靶载体；(2)取小鼠ES细胞，进行打靶载体的电转，电转后筛选鉴定阳性克隆，得到TIM3人源化ES细胞。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于所述打靶载体的序列如SEQIDNo:4所示。5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述小鼠为BALB/c或C57BL/6小鼠。6.一种TIM3人源化动物模型的构建方法，其特征在于采用权利要求1-5任一项所述的方法制备得到的TIM3人源化ES细胞注射入小鼠囊胚，将囊胚移植到代孕母体中，进行饲养，移植受体生出的小鼠为F0代小鼠，挑选毛色嵌合率高于50％的性成熟雄鼠与同背景野生型动物配繁获得F1代，经基因型鉴定正确的小鼠即为TIM3人源化动物模型。7.一种双靶点基因修饰TIM3人源化动物模型的构建方法，其特征在于采用权利要求1-6任一项所述的方法制备得到的TIM3人源化动物与非TIM3的免疫检查点人源化鼠配繁获得双靶点人源化鼠。8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于所述非TIM3的免疫检查点基因选自CD137、PD-1、PD-L1、OX40、CTLA4、TIGIT、BTLA、LAG3、CD28、CD40、ICOS、CD47、SIRPa或VISTA。9.根据权利要求7或8所述构建方法制备得到的TIM3人源化动物模型在免疫检查点激活或抑制药物活性筛选及评价中的应用。2CN110499328A说明书1/8页一种TIM3人源化小鼠模型的构建方法及其应用技术领域[0001]本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及基于基因编辑技术的TIM3基因修饰人源化动物模型的构建方法。背景技术[0002]癌症免疫疗法是借助人体自身的免疫系统，去攻击癌细胞的治疗方法。免疫系统和癌细胞之间的抗衡是一个长期博弈的动态过程，既正面交锋也相互交织。健康机体的免疫细胞能够发现和杀灭大部分癌变细胞，但在各种先天或者后天因素的诱导下，免疫系统会失去绝对优势，甚至被癌细胞“策反”，成为癌症发生和发展中关键的一员。[0003]肿瘤免疫治疗的种类众多，但其本质上大多都是通过T细胞发挥抗肿瘤作用，包括细胞因子刺激、小分子药物和最新的免疫检查点疗法等都是间接或者直接的激活人体T细胞来清除肿瘤细胞。癌症在恶化的过程中，肿瘤细胞经常会阻碍T细胞对肿瘤的“免疫监视”作用，从而导致免疫逃逸现象的出现。由于T细胞是免疫检查点疗法的核心力量，因而T细胞活性的阻断势必会影响该疗法的效果。针对免疫检查点的治疗是增强T细胞激活的有效策略之一，也是近些年抗肿瘤药物开发最热门靶点。目前临床研究最为透彻的免疫检查点分子有：细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA-4