一种脱细胞神经支架及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109908403A(43)申请公布日2019.06.21(21)申请号201910016735.6(22)申请日2019.01.08(71)申请人王伟地址121000辽宁省锦州市古塔区人民路五段2号申请人锦州医科大学(72)发明人王伟李杰马义勇智晓东李宇张玉强张振宇管树军邱裕佳段思腾张臣鸣曹宇(74)专利代理机构北京轻创知识产权代理有限公司11212代理人徐苏明(51)Int.Cl.A61L27/36(2006.01)A61L27/50(2006.01)权利要求书2页说明书6页附图6页(54)发明名称一种脱细胞神经支架及其制备方法(57)摘要本发明涉及一种脱细胞神经支架的制备方法，包括以下步骤：取离体神经组织进行预处理；将经过预处理的所述离体神经组织进行反复冻融；对所述离体神经进行低渗处理；对所述离体神经用含有去垢剂的溶液处理脱除细胞并用核酸酶处理，清洗后得到脱细胞神经支架。通过使用本发明方法，在最大程度保留神经基膜管和神经基质结构的同时，充分去除脂质、蛋白质和核酸等抗原性成分。CN109908403ACN109908403A权利要求书1/2页1.一种脱细胞神经支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.取离体神经组织进行预处理；S2.将经过预处理的所述离体神经组织进行反复冻融；S3.将步骤S2处理后的所述离体神经组织进行低渗处理；S4.脱细胞：将步骤S3处理后的所述离体神经组织用含有去垢剂的溶液处理脱除细胞，并用PBS缓冲液清洗；S5.核酸酶处理：用含DNA酶和RNA酶的混合溶液处理脱除细胞后残留的核酸成分，并用PBS缓冲液清洗，得到脱细胞神经支架。2.根据权利要求1所述的一种脱细胞神经支架的制备方法，其特征在于，所述预处理包括剔除神经外血管、脂肪及结缔组织。3.根据权利要求1所述的一种脱细胞神经支架的制备方法，其特征在于，步骤S2通过以下方式实现：将经过预处理的所述离体神经组织置于液氮中1～3min，25～37℃放置3～10min，重复操作3～4次。4.根据权利要求1所述的一种脱细胞神经支架的制备方法，其特征在于，步骤S3通过以下方式实现：将步骤S2处理后的所述离体神经组织在25～37℃下浸渍于低渗液中3～6h。5.根据权利要求1所述的一种脱细胞神经支架的制备方法，其特征在于，S4包括以下步骤：S41.将步骤S3处理后的所述离体神经组织置于含有SB-10的溶液中，在20～25℃、以80～100次/分钟的频率震荡浸泡12～18h；S42.将S41处理后的所述离体神经组织置于含有TritonX-200和SB-16的混合液中，在20～25℃，以80～100次/分钟的频率震荡浸泡9～12h，然后用灭菌的PBS缓冲液清洗；S43.将S42处理后的所述离体神经组织置于含有SB-10的等渗液Ⅰ中，在10～15℃下，以80～100次/分钟的频率震荡浸泡6～9h，然后用灭菌的PBS缓冲液清洗；S44.将S43处理后的离体神经组织置于含有TritonX-200和SB-16的等渗液Ⅱ中，在10～15℃下，以80～100次/分钟的频率震荡浸泡9～12h，然后用灭菌的PBS缓冲液清洗；完成S44后，再依次进行一次S43和S44的处理。6.根据权利要求5所述的一种脱细胞神经支架的制备方法，其特征在于，所述等渗液Ⅰ还含有95～105mmol/L乳糖钾盐、20～30mmol/L磷酸二氢钾、3～8mmol/L硫酸镁、3～8mmol/L腺苷、25～35mmol/L棉糖、2～6mmol/L谷胱甘肽、0.2～0.4U/L胰岛素、50～100mg/L青霉素、0.2～0.5mg/L地塞米松、0.5～1.5mmol/L别嘌呤醇、45～55g/L羟乙基淀粉。7.根据权利要求5所述的一种脱细胞神经支架的制备方法，其特征在于，所述等渗液Ⅱ还含有95～105mmol/L乳糖钾盐、20～30mmol/L磷酸二氢钾、3～8mmol/L硫酸镁、3～8mmol/L腺苷、25～35mmol/L棉糖、2～6mmol/L谷胱甘肽、0.2～0.4U/L胰岛素、50～100mg/L青霉素、0.2～0.5mg/L地塞米松、0.5～1.5mmol/L别嘌呤醇、45～55g/L羟乙基淀粉。8.根据权利要求5所述的一种脱细胞神经支架的制备方法，其特征在于，步骤S41和S43中，SB-10的工作浓度为125mmol/L，步骤S42和S44中TritonX-200工作时的质量分数为0.14％，SB-16的工作浓度为0.6mmol/L。9.根据权利要求1所述的一种脱细胞神经支架的制备方法，其特征在于，含DNA酶和RNA酶的混合溶液处理的时间为1～4h，所述DNA酶和RNA酶的工作浓度分别为0.2mg/mL、20mg/2CN1