一种快速、安全、无毒的RNA提取方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110343696A(43)申请公布日2019.10.18(21)申请号201910555079.7(22)申请日2019.06.25(71)申请人中国药科大学地址210009江苏省南京市鼓楼区童家巷24号(72)发明人顾月清张行陈红红(74)专利代理机构南京经纬专利商标代理有限公司32200代理人黄欣(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)权利要求书1页说明书3页附图1页(54)发明名称一种快速、安全、无毒的RNA提取方法(57)摘要本发明公开了一种快速、安全、无毒的RNA提取方法，先在样本中加入裂解液和蛋白酶K工作液，使样本裂解释放出DNA/RNA，再采用氯仿抽提得到核酸水溶液，然后加入核酸助沉剂，向得到的固体核酸中，加入DNase1消化液去除DNA残留，之后加入DNase1终止液使DNase1失活，即可。本发明的方法可以高效去除样本中的蛋白质、脂类、无机盐等杂质，提取的核酸纯度高，片段完整，提取过程快速安全无毒。CN110343696ACN110343696A权利要求书1/1页1.一种快速、安全、无毒的RNA提取方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1，在样本中加入裂解液和蛋白酶K工作液，使样本裂解释放出DNA/RNA；步骤2，向步骤1得到的裂解混合液中加入氯仿抽提，混匀、静置、离心，取上清，得到核酸水溶液；步骤3，向步骤2得到的核酸水溶液中加入核酸助沉剂，混匀、静置、离心，弃去上清，得到固体核酸；步骤4，向步骤3得到的固体核酸中，加入DNase1消化液去除DNA残留，然后加入DNase1终止液使DNase1失活，即可。2.根据权利要求1所述的RNA提取方法，其特征在于：步骤1中蛋白酶K工作液的终浓度为187-281μg/mL。3.根据权利要求1所述的RNA提取方法，其特征在于：所述裂解液包括：β-巯基乙醇1%-2%v/v、Proclin3000.2%-2%v/v、50-55mMHEPES酸、50-55mMHEPES-Na盐、10-15mMEDTA、1.2-1.5M氯化锂、187-220mM十二烷基硫酸锂；裂解液pH值为4.5-6.8。4.根据权利要求1所述的RNA提取方法，其特征在于：所述核酸助沉剂为75%乙醇和异丙醇按体积比2：1混合的混合液。5.根据权利要求1所述的RNA提取方法，其特征在于：所述DNase1终止液为20mM二水合EDTA二钠溶液。6.根据权利要求1所述的RNA提取方法，其特征在于：步骤1中加入蛋白酶K工作液后的裂解条件为58℃-65℃、20min。7.根据权利要求1所述的RNA提取方法，其特征在于：步骤4中DNase1消化液的反应条件是37℃水浴孵育30min。8.根据权利要求1所述的RNA提取方法，其特征在于：步骤4中DNase1终止液的反应条件是65℃水浴孵育10min。9.权利要求1所述的方法在组织样本、拭子洗液、分泌物、细菌、粪便、细胞样本RNA提取中的应用。2CN110343696A说明书1/3页一种快速、安全、无毒的RNA提取方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速、安全、无毒的RNA提取方法。背景技术[0002]分子生物学研究中提取纯化RNA是一项基础性工作，各种临床检测或者基础科研中都需要提取纯化RNA。RNA提取纯化的难点在于：一是样本裂解不完全，RNA没有完全释放出来，二是由于DNA残留严重导致RNA纯度不高，对下游使用RT-PCR一步法进行检测分析造成不利影响。[0003]目前国内外提取纯化RNA的方法主要有异硫氰酸胍一步法提取RNA（Trizol法）、硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、CTAB法、柱提取法等，这些方法所用到的苯酚和胍盐的毒性都很大，在通过苯酚氯仿有机分相的方法来去除DNA残留过程中会有大量的RNA损失，导致检测灵敏度低，约在1000copies/mL左右，检测范围窄，一般在1.00E+03copies/mL-1.00E+07copies/mL之间，对于高临床值（大于5.00E+07copies/mL）和低临床值（小于1.00E+03copies/mL）的样本无法检测到，而柱提取法操作步骤繁琐需频繁更换离心管，用时长，特异性差，成本高，不易操作。[0004]因此，目前迫切需要一种毒性小、样本裂解完全、DNA残留去除彻底、无RT-PCR抑制物的RNA提取方法，可以将提取的RNA直接用RT-PCR的一步法检测。发明内容[0005]本发明的目的是解决上述现有技术的不足，提供一种不使用苯酚、胍盐等毒性物质，的无DNA残留的RNA提取方法，并且能够有效解决样本裂解不完全，RNA释放不彻底以及RNA提取纯化中的DNA残留问题。[0006]为了实现上述