一种悬钩子属植物总RNA的快速提取方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109280661A(43)申请公布日2019.01.29(21)申请号201710596513.7(22)申请日2017.07.20(71)申请人周琪地址610000四川省成都市成华区龙潭乡桂林村5组52号(72)发明人周琪(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)权利要求书1页说明书3页(54)发明名称一种悬钩子属植物总RNA的快速提取方法(57)摘要本发明公开了一种悬钩子属植物总RNA的快速提取方法，取少量悬钩子属植物材料，液氮冷冻下研磨成粉，经过可选的去糖、离心步骤，或直接加入碱性细胞裂解液，进行温浴裂解；完成后通过酚-弱酸-氯仿抽提，离心去除蛋白以及绝大部分基因组DNA；上清液中加入醇进行沉淀；离心收集RNA沉淀，经过乙醇洗涤、风干后用DEPC灭菌水溶解，-80℃保存。与已有CTAB法相比，本发明可以快速提取悬钩子属植物各器官组织总RNA，用时短，在3小时之内可以轻松完成，而已有方法需要12小时以上。为达到去除蛋白质、多糖以及基因组DNA的目的，传统方法需经过2～3轮抽提及2轮以上沉淀，操作步骤繁琐，本方法只进行1轮抽提及1轮沉淀，简化了操作流程。CN109280661ACN109280661A权利要求书1/1页1.一种悬钩子属植物总RNA的快速提取方法，其特征在于：它包括以下操作步骤：1)取2ml离心管，向离心管中加入700～1000μl去糖缓冲液，并加入5～15μlβ-巯基乙醇，于-20℃预冷5～10min；2)取新鲜植物材料或经液氮速冻后-80℃保存的植物材料0.1～0.15g，加入0.1g交联聚乙烯基吡咯烷酮，在液氮冷冻条件下研磨成粉状，迅速转移至步骤1)的离心管中，温柔上下颠倒混匀后于冰上静置10min；3)在4℃下按照3200×g离心5～10min；4)彻底去除步骤3)离心所得上清液，向沉淀中加入700～1000μl65℃预热的细胞裂解液，涡旋1min，于55～65℃保温20～30min；5)待步骤4)中的混合液冷却至室温后，按顺序加入细胞裂解液等体积的水饱和酚，1/80-1/50裂解液体积的pH调节剂，1/5裂解缓冲液体积的氯仿，剧烈震荡2min；6)在4℃下按照16000×g离心5～10min；7)将步骤6)离心所得上清液转入另一离心管，向管中加入上适量核酸沉淀剂，于-20℃静置30min以上，在4℃下按照16000×g离心10min后弃上清液，保留沉淀；8)将步骤7)离心所得沉淀用体积分数为70～75％乙醇洗涤后室温风干，用DEPC处理水溶解后-80℃保存。2.根据权利要求1所述悬钩子属植物总RNA的快速提取方法，其特征在于：所述去糖缓冲液为：0.05M氯化钠、50mMpH8.0的乙二胺四乙酸二钠、200mMpH8.0的三羟甲基氨基甲烷。3.根据权利要求1所述悬钩子属植物总RNA的快速提取方法，其特征在于：使用碱性细胞裂解液裂解细胞，所述细胞裂解液为：30g/L十六烷基三甲基溴化铵、1.4M氯化钠、50～100mMpH8.0的乙二胺四乙酸二钠、100～200mMpH8.0的三羟甲基氨基甲烷以及20g/L聚乙烯吡咯烷酮K30。4.根据权利要求1所述悬钩子属植物总RNA的快速提取方法，其特征在于：在细胞彻底裂解后，再使用pH调节剂调节混合液pH，使用的pH调节剂包括但不限于弱酸如冰醋酸、草酸。5.根据权利要求1所述悬钩子属植物总RNA的快速提取方法，其特征在于：使用的核酸沉淀剂包括但不限于无水乙醇、异丙醇。6.根据权利要求1所述悬钩子属植物总RNA的快速提取方法，其特征在于：核酸沉淀时，使用的无水乙醇体积为上清体积的2～2.5倍；使用异丙醇体积为上清体积的0.8～1倍。7.根据权利要求1所述悬钩子属植物总RNA的快速提取方法，其特征在于：其适用于悬钩子属下的树莓、黑莓以及其他种或变种。8.根据权利要求1所述悬钩子属植物总RNA的快速提取方法，其特征在于：其中植物材料包括但不限于果实、叶片及花。2CN109280661A说明书1/3页一种悬钩子属植物总RNA的快速提取方法技术领域[0001]本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一种悬钩子属植物总RNA的快速提取方法。背景技术[0002]获得高质量总RNA是进行分子生物学研究如基因表达水平研究、基因操作如RNA干扰、转基因等下游研究的前提条件。悬钩子属植物的树莓、黑刺莓中富含有花青素苷、原花青素等多酚类次生代谢产物，这些物质给总RNA提取带来了重重困难：酚类化合物极易被氧化成褐色物质，然后与RNA不可逆地结合，导致RNA活性丧失，或形成不溶复合物导致在用氯仿抽提时RNA的大量丢失。[0003]Trizol试剂盒在应对该类植物总RNA提取时显得无能为力，而传统的总R