一种检测喹乙醇残留的荧光微球免疫层析试纸条及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110927375A(43)申请公布日2020.03.27(21)申请号201910948173.9G01N21/64(2006.01)(22)申请日2019.10.08(71)申请人杭州佰昕科技有限公司地址310016浙江省杭州市经济技术开发区宝龙商业中心1幢1016室申请人浙江工商大学(72)发明人王赛赛金仁耀翟璐郭建军(74)专利代理机构杭州天昊专利代理事务所(特殊普通合伙)33283代理人向庆宁(51)Int.Cl.G01N33/577(2006.01)G01N33/558(2006.01)G01N33/543(2006.01)G01N33/533(2006.01)权利要求书3页说明书11页附图2页(54)发明名称一种检测喹乙醇残留的荧光微球免疫层析试纸条及其应用(57)摘要本发明公开了一种检测喹乙醇残留的荧光微球免疫层析试纸条及其应用，本发明的试纸条能够对水、饲料中的喹乙醇进行定性和定量检测，样品前处理过程简单，方便快捷，检测时间短，试纸条具有很高的精密度和灵敏度；而且本发明制备的抗喹乙醇单克隆抗体特异性强，采用荧光微球标记的抗喹乙醇单克隆抗体，荧光微球的发光强度和检测信号可随着激发光强度的增强而增强，所以荧光微球标记抗喹乙醇单克隆抗体能有效提高免疫层析技术的分析灵敏度，与传统的胶体金免疫层析法相比，本发明的免疫分析法具有更高的灵敏度；同时由于荧光微球具有相对稳定的形态结构，微球粒度均一，分散性和稳定性好，发光效率高，重复性好，染料荧光猝灭大大减少。CN110927375ACN110927375A权利要求书1/3页1.一种检测喹乙醇残留的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，包括底板、样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴在底板上，样品结合垫的末端与硝酸纤维素膜的始端连接，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样品结合垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；所述样品结合垫上包埋有荧光微球标记的抗喹乙醇单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区；检测区位于接近样品结合垫的一侧，质控区位于远离样品结合垫的一侧，质控区喷涂有羊抗鼠二抗，检测区喷涂有喹乙醇半抗原-载体蛋白偶联物，所述喹乙醇半抗原-载体蛋白偶联物为喹乙醇半抗原-卵清白蛋白偶联物OLA-A-OVA，喹乙醇半抗原-卵清白蛋白偶联物由以下步骤制备得到：(1)向烧瓶中准确加入2.106g喹乙醇和2.274g的oxocane-2,8-dione，加入80-90mL吡啶，115℃下回流反应5-6h后减压蒸除吡啶，向剩余混合物中加入60mL冰蒸馏水，2mol·L-1HCl调pH至2.0～3.0，4℃下放置过夜；减压抽滤并用冰蒸馏水洗涤后抽干，得到的物质即为喹乙醇半抗原OLA-A，-A表示-CO(CH2)5COOH；合成路线为：(2)取0.04mmolOLA-A溶于0.8-1.0mLDMF中，加入0.04mmolN-羟基琥珀酰亚胺和0.04mmol二环己基碳二亚胺，室温下避光搅拌反应10-12h后2000r·min-1离心10min，离心后上清液为a液；(3)称取20mgOVA或者BSA溶于5mL0.01mol·L-1，pH＝7.4磷酸盐缓冲液中，此为b液；(4)4℃下将0.6mLa液逐滴加入到b液中，4℃搅拌反应过夜；次日转入透析袋内，0.01mol·L-1L，pH＝7.4的磷酸盐缓冲液透析2天，离心弃沉淀，得到偶联物，命名为OLA-A-OVA或者OLA-A-BSA，-A-表示-CO(CH2)5COO-；合成路线为：2CN110927375A权利要求书2/3页2.根据权利要求1所述的一种检测喹乙醇残留的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述底板为聚氯乙烯底板；所述样品结合垫为玻璃棉；所述吸水垫为吸水纸。3.根据权利要求1所述的一种检测喹乙醇残留的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述喹乙醇单克隆抗体是由喹乙醇半抗原与载体蛋白偶联制备人工抗原，免疫小鼠后筛选获得，载体蛋白为卵清白蛋白或者牛血清白蛋白。4.根据权利要求1所述的一种检测喹乙醇残留的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述荧光微球是直径100～300nm的用聚苯乙烯包裹荧光物质的微球，微球表面连接有羧基官能团，所述荧光物质为铕的配合物。5.根据权利要求1所述的一种检测喹乙醇残留的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，荧光微球标记抗喹乙醇单克隆抗体的制备包括以下步骤：1)活化：取内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液100μL混悬于900μL活化缓冲液中，于4℃条件下10000r·min-1离心10min后移除上清液，用1mL活化缓冲液重新悬浮微球2次后，加入200μ