一种检测喹乙醇残留的荧光微球免疫层析试纸条及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110927383A(43)申请公布日2020.03.27(21)申请号201910948223.3C07K1/107(2006.01)(22)申请日2019.10.08G01N33/533(2006.01)(71)申请人杭州佰昕科技有限公司地址310016浙江省杭州市经济技术开发区宝龙商业中心1幢1016室申请人浙江工商大学(72)发明人王赛赛金仁耀翟璐郭建军(74)专利代理机构杭州天昊专利代理事务所(特殊普通合伙)33283代理人向庆宁(51)Int.Cl.G01N33/58(2006.01)G01N33/577(2006.01)G01N33/558(2006.01)C07K14/77(2006.01)权利要求书4页说明书12页附图3页(54)发明名称一种检测喹乙醇残留的荧光微球免疫层析试纸条及其应用(57)摘要本发明公开了一种检测喹乙醇残留的荧光微球免疫层析试纸条及其应用，本发明的试纸条能够对水、饲料中的喹乙醇进行定性和定量检测，样品前处理过程简单，方便快捷，检测时间短，试纸条具有很高的精密度和灵敏度；而且本发明制备的抗喹乙醇单克隆抗体特异性强，采用荧光微球标记的抗喹乙醇单克隆抗体，荧光微球的发光强度和检测信号可随着激发光强度的增强而增强，所以荧光微球标记抗喹乙醇单克隆抗体能有效提高免疫层析技术的分析灵敏度，与传统的胶体金免疫层析法相比，本发明的分析法具有更高的灵敏度；同时由于荧光微球具有相对稳定的形态结构，微球粒度均一，分散性和稳定性好，发光效率高，重复性好，染料荧光猝灭大大减少。CN110927383ACN110927383A权利要求书1/4页1.一种检测喹乙醇残留的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，包括底板、样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴在底板上，样品结合垫的末端与硝酸纤维素膜的始端连接，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样品结合垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；所述样品结合垫上包埋有荧光微球标记的抗喹乙醇单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区；检测区位于接近样品结合垫的一侧，质控区位于远离样品结合垫的一侧，质控区喷涂有羊抗鼠二抗，检测区喷涂有喹乙醇半抗原-载体蛋白偶联物，所述喹乙醇半抗原-载体蛋白偶联物为喹乙醇半抗原-卵清白蛋白偶联物OLA-A-OVA，喹乙醇半抗原-卵清白蛋白偶联物由以下步骤制备得到：(1)喹乙醇半抗原的合成(1.1)将1mmol喹乙醇溶于2-5mLTHF中，0℃下加入1.0-1.2mmolNaH，搅拌0.5-2小时，后加入1mmol的5-溴-2,4-二烯戊酸乙酯，65℃下反应6-8小时，待反应完全后，加入30-50mLH2O，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，旋干溶剂，经柱层析分离得到OLA-A1，A1为-CH＝CH-CH＝CH-COOCH2CH3；(1.2)将1mmolOLA-A1溶于8-12mL甲醇与水的混合液中，其中，甲醇与水的体积均为5mL)，加入氢氧化锂1-1.5mmol，搅拌，室温下反应1-3h；反应完全后，用1mol/L的盐酸溶液调节pH等于5-6，乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，再用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，得产物OLA-A，-A为-CH＝CH-CH＝CH-COOH；具体的合成路线如下：2CN110927383A权利要求书2/4页(2)喹乙醇人工抗原的合成取0.04mmolOLA-A溶于0.8-1.0mLDMF中，加入0.04mmolN-羟基琥珀酰亚胺和0.04mmol二环己基碳二亚胺，室温下避光搅拌反应10-12h后2000r/min离心10min，离心后上清液为a液；称取20mgOVA(或BSA)溶于5mL0.01mmol/L，pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，此为b液；4℃下将0.6mLa液逐滴加入到b液中，4℃搅拌反应过夜；次日转入透析袋内，0.01mmol/L，pH＝7.4的磷酸盐缓冲液透析2天，离心弃沉淀，得到交联产物，命名为OLA-A-OVA或OLA-A-BSA，-A-表示-CH＝CH-CH＝CH-COO-；具体的合成路线如下：3CN110927383A权利要求书3/4页2.根据权利要求1所述的一种检测喹乙醇残留的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述底板为聚氯乙烯底板；所述样品结合垫为玻璃棉；所述吸水垫为吸水纸。3.根据权利要求1所述的一种检测喹乙醇残留的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述喹乙醇单克隆抗体是由喹乙醇半抗原与载体蛋白偶联制备人工抗原，免疫小鼠后筛选获得，载体蛋白为卵清白蛋白或者牛血清白蛋白。4.根据权利要求1所述的一种检测喹乙醇残留的荧光微球免疫层析试纸条，其