一种外泌体的制备方法及应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111434769A(43)申请公布日2020.07.21(21)申请号201910036781.2G01N33/574(2006.01)(22)申请日2019.01.15(71)申请人中国科学院分子细胞科学卓越创新中心地址200031上海市徐汇区岳阳路320号35号楼(72)发明人曾嵘吴家睿李辰陈曦(74)专利代理机构上海光华专利事务所(普通合伙)31219代理人许亦琳余明伟(51)Int.Cl.C12N5/09(2010.01)C12N5/071(2010.01)C12Q1/02(2006.01)G01N33/68(2006.01)权利要求书2页说明书17页附图15页(54)发明名称一种外泌体的制备方法及应用(57)摘要本发明涉及一种外泌体的制备方法及应用，所述方法至少包括以下步骤：采用差速离心法对类器官的培养上清液进行处理，分离得到所述外泌体。本发明所述的制备方法可高效分离和提纯所述外泌体，所述类器官外泌体既能够保留原位组织的特征，又可以提供细胞间、组织细胞与胞外基质的信息，类器官外泌体可以提供更为靶向的、更为全面的原位组织的特质，有利于研究对癌细胞之间以及癌细胞与细胞质基质的了解，推动癌症的治疗。CN111434769ACN111434769A权利要求书1/2页1.一种外泌体的制备方法，其特征在于，所述方法至少包括以下步骤：采用差速离心法对类器官的培养上清液进行处理，分离得到所述外泌体。2.如权利要求1所述的外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法至少包括5次离心。3.如权利要求1所述的外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法至少包括以下步骤：1)离心去除活细胞；2)离心去除死细胞；3)离心去除细胞碎片；4)离心去除囊泡结构；5)离心得到外泌体。4.如权利要求3所述的外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法至少包括以下步骤：1)去除活细胞：对类器官培养上清进行离心，离心条件为4℃，300g-500g，10分钟，得到上清液1和沉淀1；2)去除死细胞：对上清1进行离心，离心条件为4℃，2,000g，10-20分钟，得到上清液2和沉淀2；3)去除细胞碎片：对上清2进行离心，离心条件为4℃，10,000g，20-30分钟，得到上清液3和沉淀3；4)去除囊泡结构：对上清3进行离心，离心条件为4℃，100,000g，70-120分钟，得到上清液4和沉淀4；5)得到外泌体：对上清4进行离心，离心条件为4℃，100,000g，70-120分钟，得到上清液5和沉淀5；所述沉淀5即为所述外泌体。5.如权利要求4所述的外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法至少包括以下步骤：1)去除活细胞：对类器官培养上清进行离心，离心条件为4℃，500g，10分钟，得到上清液1和沉淀1；2)去除死细胞：对沉淀1进行离心，离心条件为4℃，2000g，20分钟，得到上清液2和沉淀2；3)去除细胞碎片：对沉淀2进行离心，离心条件为4℃，10000g，30分钟，得到上清液3和沉淀3；4)去除囊泡结构：对沉淀3进行离心，离心条件为4℃，100000g，120分钟，得到上清液4和沉淀4；5)得到外泌体：对沉淀4进行离心，离心条件为4℃，100000g，120分钟，得到上清液5和沉淀5；所述沉淀5即为所述外泌体。6.如权利要求4或5所述的外泌体的制备方法，其特征在于，步骤5)中，在离心之前，对所述上清液4进行重悬。2CN111434769A权利要求书2/2页7.如权利要求1所述的外泌体的制备方法，其特征在于，所述类器官为癌组织、癌旁组织或正常组织，经体外3D立体培养获得的类器官。8.一种外泌体，由权利要求1-7任一所述方法制得。9.如权利要求8所述的外泌体的检测方法，至少包括以下步骤：1)将所述外泌体冻干，进行溶液内酶解，得到肽段；2)对步骤1)中得到的所述肽段进行脱盐，得到脱盐肽段；3)对步骤2)中得到的脱盐肽段进行荧光定量；4)对步骤2)中得到的脱盐肽段进行质谱分析。10.如权利要求9所述的外泌体检测方法，其特征在于，步骤4)中，根据步骤2)中脱盐肽段的序列信息，采用与其序列相同的相应重标脱盐肽段进行质谱分析。11.权利要求8所述外泌体在制备肿瘤治疗药物和/或肿瘤分子标记物中的应用。3CN111434769A说明书1/17页一种外泌体的制备方法及应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种外泌体的制备方法及应用。背景技术[0002]外泌体是由大多数细胞分泌的，直径约为30-150纳米，具有脂质双层膜结构的微小膜泡，其包含特异性蛋白质、脂质和核酸。外泌体不仅在干细胞分化和维持、组织修复和组织再生、免疫系统、妊娠中胚胎着床和胎盘发育、生殖等重要生理活动中扮演角色，同时