一种外泌体及其制备方法与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109777770A(43)申请公布日2019.05.21(21)申请号201910104404.8(22)申请日2019.02.01(71)申请人中国农业科学院特产研究所地址130112吉林省长春市净月经济开发区聚业大街4899号(72)发明人杨春孙胜楠彭英华张琦郭佳杨敏刘莹(74)专利代理机构哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司23211代理人邓宇(51)Int.Cl.C12N5/0775(2010.01)A61K35/28(2015.01)A61P25/28(2006.01)权利要求书1页说明书9页序列表2页附图4页(54)发明名称一种外泌体及其制备方法与应用(57)摘要一种外泌体及其制备方法与应用，涉及外泌体医药领域。针对如何解决术后认知功能障碍的问题，本发明从鹿茸组织中分离获得间充质干细胞；经培养后，收集细胞培养液，经分离提取鹿茸间充质干细胞来源的外泌体。经证实，能够减轻CPB大鼠神经功能损伤、氧化应激反应，对CPB大鼠神经元凋亡具有保护作用，还可以通过TLR2/TLR4信号通路缓解CPB大鼠POCD。本发明可用于制备改善或治疗认知功能障碍药物。CN109777770ACN109777770A权利要求书1/1页1.一种外泌体，其特征在于，所述外泌体为鹿茸间充质干细胞来源的外泌体。2.权利要求1所述外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)鹿茸间充质干细胞的原代分离和培养：将鹿茸组织经预处理后，获取间充质区，分离获得间充质干细胞；2)鹿茸间充质干细胞外泌体的提取：将步骤1)中获得的间充质干细胞经培养后，收集细胞培养液，经分离提取得到外泌体。3.根据权利要求2所述外泌体的制备方法，其特征在于，步骤1)所述鹿茸组织为新鲜鹿茸的尖部组织。4.根据权利要求2所述外泌体的制备方法，其特征在于，步骤1)所述预处理是指将鹿茸组织去除残血，纵向切成4半，依次经75％酒精溶液、磷酸缓冲盐溶液PBS清洗；将清洗后的鹿茸剥离真皮层，然后经磷酸缓冲盐溶液PBS清洗后，用含10％胎牛血清和双抗的高糖培养基清洗；所述双抗是指终浓度为100U/mL青霉素和终浓度为100μg/mL链霉素。5.根据权利要求2所述外泌体的制备方法，其特征在于，步骤1)所述间充质干细胞的分离方法为：①鹿茸间充质干细胞的原代分离：将预处理后的间充质区切碎成沫状放入到含有双抗的低糖培养基里，加入磷酸缓冲盐溶液PBS或低糖培养基，1000×g离心8min，离心弃上清，然后用磷酸缓冲盐溶液PBS清洗沉淀，获得鹿茸间充质区组织团；所述双抗是指终浓度为100U/mL的青霉素和终浓度为100μg/mL链霉素；②鹿茸间充质干细胞的消化：向鹿茸间充质区组织团加入组织团体积4到5倍的终浓度为0.075g/mL胶原酶I溶液，37℃，消化3-6h；③铺板：加入磷酸缓冲盐溶液PBS或者低糖培养基中止消化，然后离心，弃上清，用磷酸缓冲盐溶液PBS清洗沉淀后弃废液，用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基悬浮沉淀，然后铺板，每2天换液，鹿茸间充质干细胞培养达到融合度达到80％即可。6.根据权利要求2所述外泌体的制备方法，其特征在于，步骤2)所述间充质干细胞采用胰酶消化法体外培养。7.根据权利要求6所述外泌体的制备方法，其特征在于，步骤2)所述体外培养，方法如下：将鹿茸间充质干细胞加入到含有10％无外泌体胎牛血清DMEM/F12培养基中，在37℃和5％CO2条件下，培养48h，收集含鹿茸间充质干细胞外泌体的粗液。8.根据权利要求2所述外泌体的制备方法，其特征在于，步骤2)所述分离提取的方法如下：以200mL含鹿茸间充质干细胞外泌体的粗液计，将含鹿茸间充质干细胞外泌体的粗液经300×g离心10min，取上清；再经2,000×g离心10min，取上清；然后经10000×g离心30min，取上清，用0.22μm滤器进行过滤；获得的滤液经120,000×g离心90min，然后将离心获得的上清缓慢吸出，当上清与管底距离0.5cm时加入1mLPBS，进行吹打，再次将吹打形成的混合液经120,000×g离心90min，弃去上清，向离心管中加入100mLPBS，静置10min，0.22μm滤器进行过滤，获得鹿茸间充质干细胞来源的外泌体。9.权利要求1所述的外泌体在制备改善或治疗认知功能障碍药物中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述认知功能障碍包括术后认知功能障碍或因老年神经退行性疾病引起的认知功能障碍。2CN109777770A说明书1/9页一种外泌体及其制备方法与应用技术领域[0001]本发明涉及外泌体医药领域，具体涉及一种外泌体及其制备方法与应用。背景技术[0002]随着体外循环(cardiopulmonar