仿细胞结构纳米材料及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111494639A(43)申请公布日2020.08.07(21)申请号202010195491.5A61P35/00(2006.01)(22)申请日2020.03.19A61P31/12(2006.01)A61P31/04(2006.01)(71)申请人上海市东方医院（同济大学附属东C07K1/14(2006.01)方医院）地址200120上海市浦东新区即墨路150号(72)发明人刘中民乐文俊陈炳地吴敏靓梅天笑李会一张一帆(74)专利代理机构南京经纬专利商标代理有限公司32200代理人余俊杰(51)Int.Cl.A61K47/42(2017.01)A61K47/04(2006.01)A61K47/02(2006.01)A61K45/00(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图3页(54)发明名称仿细胞结构纳米材料及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了仿细胞结构纳米材料及其制备方法和应用，所述方法先对介孔纳米材料进行表面离子改性，形成亲水性的表面修饰；再对目标细胞先后进行裂解、不连续蔗糖-壳聚糖密度梯度提取等纯化处理获得目标膜蛋白，然后在超声引导下通过静电吸附原理将目标膜蛋白快速组装到介孔纳米颗粒表面上，形成由目标膜蛋白、空腔和纳米材料壁组成的仿细胞纳米结构。本发明克服了现有提取细胞膜靶向膜蛋白的随机不确定性和低纯度性，完整保留原有膜蛋白的生物活性，提高仿细胞结构纳米材料的制备效率。本发明可应用于各种细胞的膜蛋白的分离与纯化，抗肿瘤、抗病毒、抗细菌等药物递送载体，预防性和治疗性的纳米疫苗药物、或诊疗一体化纳米材料等生物医学领域。CN111494639ACN111494639A权利要求书1/1页1.仿细胞结构纳米材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)培养目标细胞，细胞状态基本要求：细胞活力高于60％，细胞纯度大于80％，细胞数目在1-25×107个/次，备用；(2)取步骤(1)目标细胞在室温下2000rmp条件下离心弃上清，沉淀采用细胞膜提取裂解液重悬、并在冰上匀浆处理，2000rmp离心、收集上清液，沉淀采用细胞膜提取裂解液重悬；(3)重复步骤(2)中的离心和重悬步骤，直至没有完整细胞；(4)混合步骤(2)和步骤(3)收集的上清液，采用蔗糖-壳聚糖密度梯度离心得到纯化的细胞膜；(5)取步骤(4)离心后每层样本，分析样本中的蛋白成分，用生理盐水稀释膜富集区域，4℃、20000g离心0.5小时，低压冻干、称重、加PBS、4℃储存；(6)对步骤(5)储存的细胞膜进行蛋白定量分析，其中膜脂质质量浓度与膜蛋白质量浓度之比为1:4-3:1时，取与膜脂质浓度相等的经过表面等离子共振技术进行亲水化修饰的介孔纳米材料或负载目标物质的多功能介孔纳米材料加入细胞膜溶液中，在超声和0-4℃条件下反应1-12小时，9000rpm离心去除未结合的细胞膜，制得仿细胞结构纳米材料。2.根据权利要求1所述的仿细胞结构纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中目标细胞为肿瘤细胞、血球细胞、细菌或真菌。3.根据权利要求1所述的仿细胞结构纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中细胞数目在1-25×107个/次，且两次离心的时长均为5min。4.根据权利要求1所述的仿细胞结构纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的细胞膜提取裂解液的配方为：20mM蔗糖，1mM壳聚糖，1mMNaOH、1mMTris/HCl，0.1mMPMSF，胰蛋白酶抑制剂100μg/mL，RNase5μg/mL，DNase5μg/mL终浓度，pH7.4。5.根据权利要求1所述的仿细胞结构纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(4)中采用蔗糖-壳聚糖密度梯度离心的具体方法为：将混合后的上清液倒入不连续蔗糖-壳聚糖密度梯度液中，蔗糖-壳聚糖密度梯度液浓度w/v分别为60％、45％和25％；然后4℃、20000g离心30min，收集蔗糖-壳聚糖密度梯度液45％/25％交界处的样本。6.根据权利要求1所述的仿细胞结构纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(6)中的介孔纳米材料为：介孔二氧化硅、介孔硅、介孔碳、金属氧化物、金属硫化物、有机聚合物、有机-无极杂化、金属中的至少一种；介孔纳米材料负载的目标物质为：抗肿瘤药物、抗病毒药物、抗细菌药物、生物活性物质中的至少一种。7.由权利要求1-6任一所述方法制备获得的仿细胞结构纳米材料。8.权利要求7所述仿细胞结构纳米材料在制备抗肿瘤、抗病毒或抗细菌药物的递送载体中的应用。2CN111494639A说明书1/6页仿细胞结构纳米材料及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于纳米技术领域，涉及生物医学应用领域的纳米材料，具体为仿细胞结构纳米材料及其制备