一种巴氯芬人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111848437A(43)申请公布日2020.10.30(21)申请号202010612001.7C07K16/44(2006.01)(22)申请日2020.06.30G01N33/53(2006.01)(71)申请人杭州同舟生物技术有限公司地址310018浙江省杭州市经济技术开发区白杨街道银海街550号2幢第二层B区(72)发明人王镇邵越水(74)专利代理机构浙江千克知识产权代理有限公司33246代理人黎双华(51)Int.Cl.C07C237/22(2006.01)C07C231/14(2006.01)C07K14/765(2006.01)C07K16/06(2006.01)权利要求书2页说明书9页附图8页(54)发明名称一种巴氯芬人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了一种巴氯芬人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。巴氯芬人工半抗原的分子结构式如式(Ⅰ)，巴氯芬人工抗原的分子结构式如式(Ⅱ)。本发明的巴氯芬人工半抗原最大程度地保留了巴氯芬的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的巴氯芬人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗巴氯芬抗体，经免疫新西兰白兔获得的免疫血清的效价高达1∶80000，可用于对巴氯芬进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。CN111848437ACN111848437A权利要求书1/2页1.一种巴氯芬人工半抗原，其特征在于，其分子结构式如(Ⅰ)所示：2.如权利要求1所述巴氯芬人工半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将巴氯酚和三氟乙酸酐按摩尔比1∶1.1混合，加入3A分子筛干燥过的苯，室温下搅拌反应1小时，接着转入80℃油浴中继续搅拌回流3小时，反应结束，冷却至室温，将溶剂减压蒸干得淡黄色油状物A；(2)将淡黄色油状物A、N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐按摩尔比1∶1.35～1.5∶2.45～3.0混合，加入二氯甲烷溶解，室温搅拌反应18小时；结束反应将反应液转入分液漏斗中，分别用0.1N的盐酸、纯化水、饱和的碳酸氢钠溶液、饱和的食盐水洗涤有机相，取有机相干燥、过滤、减压蒸干得灰白色固体B；(3)将对氨甲基苯甲酸溶于体积比为2∶1的四氢呋喃和纯化水的混合溶剂中，室温下搅拌均匀，然后加入灰白色固体B的四氢呋喃溶液，此时反应液浑浊；再加入1N的氢氧化钠水溶液，室温下搅拌反应3小时；结束反应，减压蒸干溶剂，加入双蒸水，用6N的盐酸调pH＝6，用乙酸乙酯萃取三次，收集有机相，干燥、过滤、减压蒸干、TLC薄层色谱分离得黄色油状物Ⅰ，即巴氯芬人工半抗原。3.一种巴氯芬人工抗原，其特征在于，其分子结构式如(Ⅱ)所示：式(Ⅱ)中，BSA为牛血清蛋白。4.如权利要求3所述巴氯芬人工抗原，其特征在于，所述巴氯芬人工抗原通过活泼酯法使巴氯芬人工半抗原与牛血清蛋白结合，获得巴氯芬人工抗原。5.如权利要求4所述巴氯芬人工抗原，其特征在于，包括以下步骤：(a)将巴氯芬人工半抗原Ⅰ与N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺以摩尔比为1∶1.35～1.5∶1.35～1.5溶解于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应18小时，反应结束后离心取上清液；(b)将上清液滴加到牛血清蛋白溶液中，迅速混合均匀并置于4℃的环境下静置过夜，经pH＝12.00的0.5％碳酸钠水溶液和磷酸盐缓冲溶液(PBS)透析、离心取上清液，获得巴氯芬人工抗原。2CN111848437A权利要求书2/2页6.如权利要求5所述巴氯芬人工抗原，其特征在于，步骤(b)中，所述牛血清蛋白溶液的浓度为5mg/ml，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1∶10。7.权利要求3所述巴氯芬人工抗原在制备抗巴氯芬抗体中的应用。8.一种抗巴氯芬抗体，其特征在于，是由权利要求3所述巴氯芬人工抗原经动物免疫得到的、可与巴氯芬发生特异性免疫反应的球蛋白。9.权利要求8所述抗巴氯芬抗体在检测巴氯芬中的应用。3CN111848437A说明书1/9页一种巴氯芬人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种巴氯芬人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。背景技术[0002]巴氯芬为骨骼肌松弛药，用于改善锥体束损害造成的肌张力增高的痉挛症状、不同原因造成的痉挛性偏瘫和截瘫，如多发性硬化、脑血管病、脊髓损伤和脊髓炎后遗症、儿童脑性瘫痪、破伤风、难治性呃逆等。[0003]本药口服从胃肠道迅速、完全吸收。口服后1～3h，血浆浓度到达高峰，但个体差异较大。70％～80％药物以原形从小便排出，约15％由肝脏代谢。[0004]长期使用突然停药可引起：停药综合征、头