一种微流控细胞磁捕获与检测系统及其捕获与检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111944656A(43)申请公布日2020.11.17(21)申请号202010639134.3(22)申请日2020.07.06(71)申请人东南大学地址211102江苏省南京市江宁区东南大学路2号(72)发明人马明张宇陈怡顾宁(74)专利代理机构南京苏高专利商标事务所(普通合伙)32204代理人柏尚春(51)Int.Cl.C12M1/00(2006.01)C12M1/34(2006.01)C12Q1/06(2006.01)权利要求书2页说明书6页附图3页(54)发明名称一种微流控细胞磁捕获与检测系统及其捕获与检测方法(57)摘要本发明公开一种微流控细胞磁捕获与检测系统及其捕获与检测方法。将抗趋化因子受体CXCR4的抗体(12G5)、荧光分子AlexaFluor647(F647)修饰在磁性四氧化三铁纳米颗粒表面，构建磁性荧光纳米探针，并结合微流控芯片分选与磁捕获，以及荧光定量分析仪进行急性髓系白血病耐药细胞的检测。磁性荧光纳米探针能特异性靶向急性髓系白血病耐药细胞。将细胞与纳米探针共孵育后，以一恒速通过所述微流控芯片，在微流控芯片一端的细胞捕获区外加静磁场，被磁标记的细胞由于受到磁力作用滞留在微流控芯片的细胞捕获区内，而未被磁标记的阴性细胞以及溶液中多余的纳米探针会从微流控芯片的出口流出。CN111944656ACN111944656A权利要求书1/2页1.一种微流控细胞磁捕获与检测系统，其特征在于，该系统由磁性荧光纳米探针、微流控芯片以及荧光定量分析仪三部分组成；所述磁性荧光纳米探针是表面具有特异性识别趋化因子受体CXCR4的抗体12G5的四氧化三铁纳米颗粒，所述磁性荧光纳米探针能够特异性靶向样本中的CXCR4阳性细胞；所述微流控芯片的样品入口通过样品通道与微柱阵列的过滤区的一端相连，该过滤区另一端与样品出口1联通；所述过滤区一端与一段较长的蛇形非对称弯曲通道相连，所述蛇形非对称弯曲通道与纳米探针出口3、细胞捕获区汇合，形成一个通道交汇腔；所述细胞捕获区另一端与非特异性细胞出口2相连；所述微流控芯片整体采用PDMS-玻璃键合，赋予芯片一定硬度，便于插入荧光定量分析仪实现荧光定量检测。2.根据权利要求1所述的一种微流控细胞磁捕获与检测系统，其特征在于，所述细胞捕获区为4mm×1mm的长方形微腔，内部分布了三种不同开口方向的U型结构阵列组合，U型结构中间有一10μm宽的缝隙可以让流体和非特异性细胞通过。3.根据权利要求1所述的一种微流控细胞磁捕获与检测系统，其特征在于，所述微流控芯片，其主流道的深度为40μm。4.一种如权利要求1所述微流控细胞磁捕获与检测系统的微流控细胞捕获方法，其特征在于，该检测方法包括利用磁性荧光纳米探针特异性标记样本中白血病耐药细胞，然后通过微注射泵进样到微流控芯片，分选掉游离的纳米探针、不相关细胞并特异性将磁标记的白血病耐药细胞捕获到检测区域，最后将芯片插入到荧光定量分析仪读取荧光信号。5.根据如权利要求4所述微流控细胞捕获方法，其特征在于，该捕获方法包括：步骤1、在磁性纳米颗粒Fe3O4-PEG即羧基末端聚乙二醇修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒溶液中加入抗CXCR4的抗体12G5，同时加入2-吗啉乙磺酸MES调节溶液pH至5.5～6.0，置于20～25℃摇床混匀吸附30～60min；步骤2、在反应体系中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，EDC与四氧化三铁纳米颗粒铁元素质量比为0.5～1，于20～25℃摇床进行交联反应得到反应液；步骤3、将步骤2得到的反应液通过磁分离柱纯化，以除去游离的抗体，撤去磁场，收集磁性纳米探针Fe3O4-PEG-12G5；TM步骤4、在步骤3得到的磁性纳米探针Fe3O4-PEG-12G5表面继续修饰AlexaFluor647NHSEster荧光染料简称为F647；在磁性纳米探针Fe3O4-PEG-12G5溶液中，加入荧光染料F647、0.01～0.2M硼酸盐BB、缓冲液，调节溶液pH至8～8.5，20～25℃摇床1～2小时；步骤5、过磁分离柱分离游离荧光染料，撤去磁场，收集磁性荧光纳米探针Fe3O4-PEG-12G5-F647。6.如权利要求5所述的微流控细胞捕获方法，其特征在于，在步骤1中，所述的磁性纳米颗粒与12G5抗体质量比为1～5，磁性纳米颗粒的质量浓度为0.5～1mg/mL。7.如权利要求3所述的微流控细胞捕获方法，其特征在于，在步骤1中，所述的2-吗啉乙磺酸MES为0.01～0.2M，pH5.5～6.0。8.如权利要求5所述的微流控细胞捕获方法，其特征在于，在步骤2中所述的交联反应，反应时间为2～6小时。9.如权利要求5所述的微流控细胞捕获方法，其特征在于，在步