新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112359063A(43)申请公布日2021.02.12(21)申请号202011216438.5(22)申请日2020.11.04(71)申请人安徽环球基因科技有限公司地址239000安徽省滁州市马鞍山路801号(72)发明人雍金贵李森王方平邹刚刚(74)专利代理机构合肥正则元起专利代理事务所(普通合伙)34160代理人周卫(51)Int.Cl.C12N15/866(2006.01)C07K14/165(2006.01)权利要求书2页说明书6页序列表2页附图3页(54)发明名称新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法(57)摘要本发明公开了新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法，具体包括如下步骤：载体构建，DH10Bac感受态细胞制备，转座以及杆粒的抽提与验证。该新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法，通过构建RBD重组质粒时，未加任何标签，因此后期蛋白表达时不会有任何氨基酸残留，从而减少了其他氨基酸残基对后期该蛋白的研究造成的干扰，使用昆虫HF细胞代替昆虫SF9细胞，可以在一定程度上增加了该蛋白的分泌表达质量，在最终放大过程中，48h后立即收集细胞上清进行纯化，缩短了收样时间，纯化时在上清中添加蛋白酶抑制剂且全程低温操作，大大减少了该蛋白的降解可能性，使用Biacore检测目的蛋白活性，确保了目的蛋白活性。CN112359063ACN112359063A权利要求书1/2页1.新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法，其特征在于：具体包括如下步骤：步骤一、载体构建：密码子优化后通过基因合成技术将重组RBD基因亚克隆克隆到pFastbac1中；步骤二、DH10Bac感受态细胞制备：取DH10Bac菌株，对DH10Bac菌株平板划线至双抗LB平板中，双抗LB平板中含有浓度为50μg/mgkanamycinsulfate和10μg/mgtetracyclinehydrochloride；步骤三、转座：准备含三抗显色LB平板，其中三抗显色LB平板中含有50μg/mgkanamycinsulfate、10μg/mgtetracyclinehydrochloride、7μg/mggentamicinsulphate、40μg/mgIPTG与100μg/mgX-Gal，将三抗显色LB平板转座至DH10Bac感受态中，进行蓝白斑筛选，PCR技术筛选出阳性单克隆菌落后制备Bacmid质粒；步骤四、杆粒的抽提与验证：在无菌的24孔摇菌板中加入4mL三抗LB培养基，在培养后的三抗显色板中挑取白色单克隆菌落数个分别放入摇菌板中，在温度为37℃转速为220rpm的条件下培养过夜，拿出摇菌板，取2mL的培养物分别加至2.0mL离心管中，向离心管中加入50μL无菌ddH2O，充分溶解沉淀，即为昆虫杆状病毒质粒溶液，简称杆粒，得到新冠重组RBD蛋白。2.根据权利要求1所述的新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法，其特征在于：所述RBD基因表达的序列：MKLCILLAVVAFVGLSLGRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTN*。3.根据权利要求1所述的新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法，其特征在于：所述DH10Bac感受态细胞制备的具体步骤如下：将双抗LB平板放置在温度为37℃条件下培养过夜，取3支含4mL无菌LB的试管，向3支试管中统一加入终浓度50μg/mgkanamycinsulfate、10μg/mgtetracyclinehydrochloride，分别将3支试管内部的溶液进行混匀，挑取3个单克隆分别转接至3支试管中，对3支试管均放置在温度为37℃转速为220rpm的条件下培养过夜，取1个含400mL无菌LB的三角瓶，向三角瓶中加入终浓度50μL/mgkanamycinsulfate、10μL/mgtetracyclinehydrochloride，混匀，取出3支试管培养物，比较每支长势，取1支长势正常的培养物，全部接种至三角瓶中，在温度为37℃转速为220rpm的条件下培养至OD600＝0.4-0.6，立即将三角瓶放入冰水混合物中静置30min，以停止细菌的生长，对离心机进行预冷至4℃，在温度为4℃转速为3000rpm的条件下离心10min，弃上清，加100mL预冷的0.2