利用毕赤酵母生产重组类人胶原蛋白和宿主细胞蛋白的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112724242A(43)申请公布日2021.04.30(21)申请号202011630131.XC07K14/39(2006.01)(22)申请日2020.12.30C07K1/36(2006.01)C07K1/34(2006.01)(83)生物保藏信息C07K1/18(2006.01)CGMCCNo.204582020.07.31C12N15/81(2006.01)(71)申请人西安德诺海思医疗科技有限公司C12N1/19(2006.01)地址710000陕西省西安市沣东新城科源C12R1/84(2006.01)三路137号康鸿橙方科技园1号楼B单元1层B单元2层B单元3层(72)发明人郝东王俊何华斌周浩魏文培宗奕珊侯增淼(74)专利代理机构西安通大专利代理有限责任公司61200代理人范巍(51)Int.Cl.C07K14/78(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图2页(54)发明名称利用毕赤酵母生产重组类人胶原蛋白和宿主细胞蛋白的方法(57)摘要本发明公开了一种利用毕赤酵母生产重组类人胶原蛋白和宿主细胞蛋白的方法，利用菌株Pichiapastoris‑col3‑6于发酵培养过程中进行甲醇诱导，获得的发酵液经离心、过滤除菌、超滤脱盐浓缩、离子交换层析和超滤脱盐、冻干，得到重组类人胶原蛋白和目标宿主蛋白，本发明在保持发酵生产重组类人胶原蛋白的高产率、高收率及高纯度的同时，解决了工业化大规模生产毕赤酵母表达的重组类人胶原蛋白的高成本问题。CN112724242ACN112724242A权利要求书1/1页1.一种毕赤酵母发酵液的蛋白纯化方法，其特征在于：该蛋白纯化方法包括以下步骤：将毕赤酵母发酵液中的菌体细胞分离去除后进行超滤，将超滤产物进行离子交换层析，分别得到毕赤酵母发酵产生的重组类人胶原蛋白和宿主细胞蛋白。2.根据权利要求1所述一种毕赤酵母发酵液的蛋白纯化方法，其特征在于：所述蛋白纯化方法具体包括以下步骤：1)将毕赤酵母发酵液离心，将离心所得上清液进行过滤除菌、超滤脱盐，将经超滤脱盐得到的含有重组类人胶原蛋白的浓缩液与含有宿主细胞蛋白的超滤系统残留蛋白回收液混合，得到混合料液；2)通过离子交换层析将混合料液中的重组类人胶原蛋白和宿主细胞蛋白分离。3.根据权利要求1或2所述一种毕赤酵母发酵液的蛋白纯化方法，其特征在于：所述毕赤酵母选自保藏编号为CGMCCNo.20458的菌株，所述菌株的发酵液蛋白成分包括91.3KD的重组类人胶原蛋白和65KD的宿主细胞蛋白。4.根据权利要求1或2所述一种毕赤酵母发酵液的蛋白纯化方法，其特征在于：所述毕赤酵母发酵液的制备方法包括以下步骤：将毕赤酵母于发酵培养基中进行培养和重组类人胶原蛋白的诱导表达，得到毕赤酵母发酵液。5.根据权利要求2所述一种毕赤酵母发酵液的蛋白纯化方法，其特征在于：所述超滤脱盐采用6～15KD超滤膜，所述浓缩液的电导率低于1ms/cm；所述离子交换层析采用的离子交换柱填料选自弱阳离子交换剂。6.根据权利要求2所述一种毕赤酵母发酵液的蛋白纯化方法，其特征在于：所述步骤2)具体包括以下步骤：用氢氧化钠调节混合料液的pH值至6.0～6.5，得到离子交换层析原液，用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠调节离子交换层析原液的pH值为6.0～6.5后进行上样；上样结束后，先以pH值为6.0～6.5、含有0.04～0.06mol/LNaCl的8～10mmol/L磷酸盐缓冲液作为洗脱液洗脱宿主细胞蛋白，再以pH值为6.0～6.5、含有0.08～0.1mol/LNaCl的8～10mmol/L磷酸盐缓冲液作为洗杂液进行洗脱，最后以pH值为6.0～6.5、含有0.3～0.4mol/LNaCl的8～10mmol/L磷酸盐缓冲液作为洗脱液洗脱重组类人胶原蛋白。7.根据权利要求2所述一种毕赤酵母发酵液的蛋白纯化方法，其特征在于：所述蛋白纯化方法还包括以下步骤：经过步骤2)后，将重组类人胶原蛋白溶液及宿主细胞蛋白溶液分别超滤脱盐，然后进行真空冷冻干燥，得到重组类人胶原蛋白和宿主细胞蛋白。8.一种毕赤酵母在发酵生产重组类人胶原蛋白中的应用，其特征在于：所述毕赤酵母的发酵液的蛋白纯化方法包括以下步骤：将毕赤酵母发酵液中的菌体细胞分离去除后进行超滤，将超滤产物进行离子交换层析，分别得到毕赤酵母发酵产生的重组类人胶原蛋白和宿主细胞蛋白；所述毕赤酵母选自保藏编号为CGMCCNo.20458的菌株。9.一种毕赤酵母在发酵生产蛋白Marker中的应用，其特征在于：所述毕赤酵母的发酵液的蛋白纯化方法包括以下步骤：将毕赤酵母发酵液中的菌体细胞分离去除后进行超滤，将超滤产物进行离子交换层析，分别得到毕赤酵母发酵产生的重组类人胶原蛋白和宿主细胞蛋白；