新冠重组NP蛋白在大肠杆菌中的生产方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112280794A(43)申请公布日2021.01.29(21)申请号202011211644.7(22)申请日2020.11.03(71)申请人安徽环球基因科技有限公司地址239000安徽省滁州市马鞍山路801号(72)发明人雍金贵张伦韦伟洋孙伟(74)专利代理机构合肥正则元起专利代理事务所(普通合伙)34160代理人周卫(51)Int.Cl.C12N15/50(2006.01)C12N15/70(2006.01)C07K14/165(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图1页(54)发明名称新冠重组NP蛋白在大肠杆菌中的生产方法(57)摘要本发明公开了新冠重组NP蛋白在大肠杆菌中的生产方法，该新冠重组NP蛋白在大肠杆菌中的生产方法构建NP重组质粒时，未加任何标签，因此后期蛋白表达时不会有任何氨基酸残留，从而减少了其他氨基酸残基对后期该蛋白的研究造成的干扰；步骤七中使用TB培养基代替大肠杆菌常用的LB培养基，可以在一定程度上增加了该蛋白的表达质量；步骤七中诱导4h后收集菌体进行纯化，纯化时在上清中添加蛋白酶抑制剂且全程低温冷库使用AKTA纯化仪进行操作，大大减少了该蛋白的降解可能性；通过对未感染者血清以及病人血清WesternBlot技术检测，确认了目的蛋白活性。CN112280794ACN112280794A权利要求书1/1页1.新冠重组NP蛋白在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：通过基因合成技术将重组N蛋白基因亚克隆克隆到pet28a载体中，合成重组N蛋白质粒，取1-2μL重组N蛋白质粒加入至含有100μL的大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞的EP管A中，将EP管A置于冰上静置30min后，在温度为42℃的条件下热激90s，再置于冰上静置5min；步骤二：在EP管A内加入500μL已灭菌的无抗LB培养基后，将EP管A在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡培养1h，然后在转速为3000-4000rpm的条件下将培养物离心，弃去上清液，将沉淀物涂于含有正确抗生素的LB平板上，将LB平板正置于温度为37℃的培养箱中培养30min，然后将LB平板倒置，培养过夜；步骤三：取试管，加入4mL含有正确抗生素的LB培养基，从LB平板挑取长势正常的单克隆菌斑置于试管中，将试管置于温度为37℃的摇床中以转速220rpm的条件下进行培养，取已灭菌的1.5mLEP管B，并在EP管B中加入500μL已灭菌的质量分数为50％的甘油；步骤四：制作保种菌；步骤五：制备诱导前样品；步骤六：制备诱导后样品；步骤七：取保种菌进行放大诱导、纯化。2.根据权利要求1所述的新冠重组NP蛋白在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于，步骤四所述制作保种菌的具体过程如下：当步骤三中的试管中的培养物OD600＝0.6-0.8，取出试管，从试管中取出500μL培养物加入至EP管B中，将1.5mLEP管B放入-4℃保存，后期用做保种菌。3.根据权利要求1所述的新冠重组NP蛋白在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于，步骤五所述制备诱导前样品的具体过程如下：从步骤三中的试管中取出500μL添加IPTG溶液前的培养物置于1.5mLEP管C中，在转速为12000rpm的条件下离心5min，弃去上清液，用80μL1×PBS缓冲液重悬沉淀，再向EP管C内加入20μL5×ProteinLoadingBuffer缓冲液混匀，以制备诱导前样品。4.根据权利要求1所述的新冠重组NP蛋白在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于，步骤六所述制备诱导后样品的具体过程如下：向步骤三中的试管的剩余培养物中加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG溶液，然后将试管在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡诱导4h后，从试管中取出200μL培养物,置于1.5mLEP管D中，在转速为12000rpm的条件下离心5min，弃去上清液，用80μL1×PBS重悬沉淀，再向EP管D内加入20μL5×ProteinLoadingBuffer缓冲液混匀，以制备诱导后样品；利用SDS-PAGE电泳技术检测蛋白的表达，如表达，将保种菌置于-80℃以长期保存。5.根据权利要求1所述的新冠重组NP蛋白在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于，步骤七所述取保种菌进行放大诱导、纯化的具体过程如下：取步骤四制得的保种菌以1：1000的接种浓度转接至10mL带有对应抗生素的LB培养基中，在温度为37℃的条件下培养过夜，得到接种培养基，取接种培养基以1：100的接种浓度转接1L带有对应抗生素的TB培养基，在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡培养至OD600＝0.6-0.8，然后在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡诱导