蛋白质的分离纯化概要.ppt

第一节引言(yǐnyán)一、别离纯化(chúnhuà)的意义二、别离纯化(chúnhuà)的要求三、别离纯化的一般(yībān)程序第二节蛋白质别离(fēnlí)纯化的前处理二、细胞(xìbāo)的破碎组织细胞的破碎方法很多不同的实验规模不同的实验材料和实验要求使用的破碎方法和条件也不同。一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能到达目的。细菌细胞的破碎比较困难因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡(zhèndàng)、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理〔以分解肽聚糖〕。三、细胞器的别离(fēnlí)四、提取(tíqǔ)1、蛋白质的提取(tíqǔ)第三节蛋白质别离(fēnlí)纯化一、蛋白质的别离(fēnlí)纯化〔1〕盐析(yánxī)不同的蛋白质分子由于其分子外表(biǎomiàn)的极性基团的种类、数目以及排布的不同其水化层厚度不同故盐析所需要的盐浓度也不一样因此调节蛋白质的中盐浓度可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：〔2〕等电点沉淀(chéndiàn)〔3〕有机溶剂法室温下这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀而且伴随着变性。假设预先将有机溶剂冷却然后在不断搅拌下将其逐渐参加蛋白质溶液中防止有机溶剂局部浓度过高那么在很大程度上解决变性问题。不同的蛋白质由于水化层厚度不同发生沉淀需要(xūyào)的有机溶剂浓度不同因此可利用不同浓度的有机溶剂别离不同的蛋白质。2、细分级别离酶的活力(huólì)测定第四节蛋白质纯度(chúndù)鉴定第五节蛋白质的层析别离第二十三页共六十一页。分配系数:k=Cs/Cm物质在固定相与(xiāngyǔ)流动相浓度之比。质量分配系数：D=k×Vs/VmVsVm为固定相和流动相的体积。带电蛋白质分子(fēnzǐ)与交换剂的结合是可逆的。由于pH可改变蛋白质的带电性质和带电量盐离子会影响蛋白质在交换剂上吸附。所以用一定浓度的盐溶液或一定pH的缓冲液就可把蛋白质从离子交换剂上洗脱下来。对多组分混合物每种分子所带的电荷不同因此可用不同的离子强度或不同的pH溶液将蛋白质从交换剂上一一洗脱下来。〔二〕离子交换剂的根本(jīběn)类型离子交换基团(jītuán)的结构和性质可用来作为交换剂支持物的物质种类(zhǒnglèi)较多。早期用于别离氨基酸、小肽和其它小分子物质的离子交换树脂的支持物是聚苯乙烯类。别离蛋白质的常用的亲水性支持物。有三大类：纤维素、葡聚糖凝胶(sephadex)、琼脂糖凝胶(sepharose)和合成凝胶(Trisacryl和Fractogel)。阴离子阳离子在Sephadex上接上某种离子交换基团。这种凝胶既有离子交换剂的性质又有分子筛效应。因此其别离能力比单纯(dānchún)的层析凝胶或离子交换剂好。葡聚糖凝胶离子交换剂的交换量比相应的纤维素离子交换剂大如DEAE—Sephadex的交换量大约是DEAE—纤维素的3.5～5.0倍。葡聚糖凝胶离子交换(lízǐjiāohuàn)剂的性质强阴离子交换剂QAE—SephadexA—25A—50将各种离子(lízǐ)基团引入到交联琼脂糖(SpeharoseCL)和大孔合成凝胶(Trisacryl或Fractogel)上那么形成一系列离子交换剂。这类交换剂即坚硬、吸附容量大形状球形能维持较好的流速及分辨率。〔三〕层析条件(tiáojiàn)的选择3、层析缓冲液的选择选择正确的缓冲液可获得较好的层析效果。因为离子(lízǐ)相互作用取决于pH而维持介质的pH通常是由缓冲液来实现的。所用缓冲液的种类、pH大小决定待别离组分的稳定性和溶解度。要得到好的别离效果层析时要注意层析柱的高度和体积；上样量的大小；洗脱液体积；洗脱速度；分级物的收集量。1、柱床体积：至少要比结合(jiéhé)所有样品所需要的要大2—5倍。离子交换层析所用的柱不用太长以便缩短操作时间。2、样品pH和离子强度：与起始缓冲液具有相同的pH和离子强度。3、洗脱液体积和洗脱梯度的形状：对柱的分辨率影响很大。洗脱可用恒定组成的缓冲液来完成〔简单洗脱〕也可用改变pH或盐浓度或二者均改变的洗脱液来完成。pH和盐浓度的改变又分为连续改变〔梯度洗脱〕和不连续改变〔阶段洗脱〕。交换剂的处理就是将交换剂转变为适合别离目的的离子类型。一般包括除杂质、溶胀除细粒和改型。改型就是用适当的离子平衡使交