蛋白质的分离纯化.ppt

第9章酶促反响(fǎnyìng)动力学1、酶活力与酶促反响速度酶活力：在一定条件下酶催化某一反响的反响速度(sùdù)〔一般测初速度(sùdù)〕。酶促反响速度：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。单位：浓度/单位时间研究酶促反响速度(fǎnyìngsùdù)以酶促反响的初速度为准(底物消耗≤5%〕。2、酶的活力单位〔U〕国际单位〔IU单位〕：在最适反响条件下每分钟催化1μmol底物转化为产物(chǎnwù)所需的酶量称一个国际单位〔IU〕1IU=1μmol/min国际单位〔KatalKat单位〕：在最适反响条件下每秒钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量称1Kat单位〔1Kat=1mol·s-1〕1Kat=60×106IU最适条件：最适温度〔25℃或37℃〕最适pH、最适缓冲液离子强度、最适底物浓度(nóngdù)。底物浓度〔1〕通常很大使酶饱和〔2〕底物消耗≤5%淀粉酶两种定义(dìngyì)：A：1g可溶性starch在1h内液化所需的enzyme量。B：lml2%可溶性starch在1h内液化所需的enzyme量。1g酶制剂溶于1000mlH2O取0.5ml与2%的starch20ml反响pH6.010分钟完全液化求酶活力。A：20×2%×1/0.5×1000×60/10=4800u/克enzyme制剂B：20/0.5×1000×60/10=240000u/克enzyme制剂3、酶的比活力Specificactivity每毫克酶蛋白所具有的酶活力。单位：U/mg蛋白质。酶的比活力是分析酶的含量与纯度的重要指标(zhǐbiāo)。一个酶的别离纯化分为4步。步骤1234总活力〔U〕6432总蛋白质〔mg〕201052比活力〔U/mg〕6/204/103/52/2酶的提纯过程中总蛋白减少总活力减少比活力增高。酶的纯化倍数：酶的回收率：×100%酶的别离纯化过程中一定(yīdìng)要随时追踪酶的活性4、酶活力(huólì)的测定方法P336分光光度法荧光法同位素测定法电化学法研究酶促反响(fǎnyìng)的速度以及影响酶促反响(fǎnyìng)速度的各种因素包括底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂与抑制剂等。一、化学动力学根底二、底物(dǐwù)浓度对酶反响速率的影响㈡酶促反响(fǎnyìng)的动力学方程式米式方程：Michaelis和Menten1913年修正(xiūzhèng)后的米式方程酶催化(cuīhuà)的反响中各成份的变化当[S]<<Km时米氏常数(chángshù)Km的意义在一定(yīdìng)的酶浓度下Vmax是一个常数它只与底物的种类及反响条件有关。Vmax=K3[E]K3代表酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数称为转换数〔TN或催化常数Kcat〕Kcat值越大说明酶的催化效率越高。Kcat/KmrepresentsactualcatalyticefficiencybecauseinvivoKm和Vmax的求解(qiújiě)方法1、Lineweaver-Burk双倒数作图法选底物浓度应考虑能否得到1/[S]的常数增量：[S]为1.01、1.11、1.25、1.42、1.66、2.0、2.5、3.33、5.0、10时1/[S]为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0是常数增量。[S]为常数增量1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10时1/[S]为0.1、0.111、0.125、0.5、1.0是非常(fēicháng)数增量点多集中在1/v轴附近。其他(qítā)作图法多底物酶促反响有三种(sānzhǒnɡ)动力学机理★sequentialreactions〔single-displacementreactions):▲Orderedreaction(orderedBiBi)▲Randomreactions(randomBiBi)★Pingpongreactions〔d