蛋白质分离纯化步骤.doc

一、蛋白质分离纯化的一般原则大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处所以蛋白质的分离提纯是一项复杂的工作。到目前为止还没有一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯化程序以获得高纯度的制品。且分离的关键步骤、基本手段还是共同的。蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量同时又要保持和提高产品的生物活性。因此要分离纯化某一种蛋白质首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。其次应设法避免蛋白质变性以制备有活性的蛋白质。对于大多数蛋白质来说纯化操作都是在0～4℃的低温下进行的。同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。另外还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白从而达到增加纯度和提高产量的目的。二、分离纯化蛋白质的一般程序分离纯化蛋白质的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1.机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用使细胞破碎。常用设备有高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。2.渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。3.反复冻融法生物组织经冻结后细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。4.超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。5.酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。(二)蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等）使膜结构破坏利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中应注意温度避免剧烈搅拌等以防止蛋白质的变性。(三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同可用等电点沉淀法使它们相互分离。2.盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质并能再度溶解而不变性。3.有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低进而从溶液中沉淀出来因此可用来沉淀蛋白质。此外有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性使用该法时要注意在低温下操作选择合适的有机溶剂浓度。（四）样品的进一步分离纯化用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。1.凝胶过滤层析凝胶过滤层析（gel-filtrationchromatography）又称为分子排阻层析或分子筛层析。它是将葡聚糖凝胶（Sephadex）装入一个柱子中制成凝胶柱。这种凝胶颗粒具有网状结构不同类型凝胶的网孔大小不同。当把蛋白质混合样品加到凝胶柱中时比凝胶网孔小的蛋白质可进入网孔内而大于网孔的分子则不能进入被排阻在凝胶颗粒之外。当用洗脱液洗脱时被排阻的分子量大的蛋白质直接通过凝胶之间的缝隙先被洗脱下来而比网孔小的蛋白质可连续不断地进入网孔内。这样的小分子不但流经的路程长而且受到来自凝胶内部的阻力也很大所以蛋白质越小从柱子上洗脱下来所需时间越长。由于不同蛋白质的分子大小不同进入网孔的程度不同因此流出的速度不同洗脱所用体积及时间不同从而达到分离的目的。2.纤维素柱层析法该法是利用蛋白质的酸碱性质作为分离的基础。离子交换纤维素（celluloseion-exchanger）是人工合成的纤维素衍生物它具有松散的亲水性网状结构有较大的表面积使蛋白质大分子可以自由通过。因此常用于蛋白质的分离。（1）羧甲基纤维素（CM-纤维素）在纤维素颗粒上带有羧甲基基团。在中性pH条件下羧甲基上的质子可解离下来（图2-27a）而溶