一种高效的外泌体分离纯化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113249302A(43)申请公布日2021.08.13(21)申请号202110695490.1(22)申请日2021.06.23(71)申请人北京求臻医学检验实验室有限公司地址100000北京市经济技术开发区经海四路156号院3号楼3层301(72)发明人张怡然顾丽清段小红陈玉洁王丽芬周启明(74)专利代理机构重庆百润洪知识产权代理有限公司50219代理人陈付玉(51)Int.Cl.C12N5/071(2010.01)权利要求书1页说明书4页附图2页(54)发明名称一种高效的外泌体分离纯化方法(57)摘要本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及一种高效的外泌体分离纯化方法，包括分离血浆，加入阳离子聚合物孵育；滤膜截留与阳离子聚合物结合的外泌体并漂洗外泌体；离液剂洗脱外泌体；加入磁珠吸附并富集外泌体；洗脱获得外泌体浓缩液。与现有技术相比，本发明不借助大型离心设备，采用阳离子聚合物对外泌体进行包覆后，采用离液剂解除阳离子聚合物与外泌体作用，通过简单的过滤，实现外泌体回收，然后通过磁性吸附剂对回收的外泌体进行浓缩，纯化。本发明有效缩短分离时间、提高外泌体回收效率、提高处理样本通量、提升外泌体分离纯度、降低外泌体分离所需试剂及耗材成本，分离得到的高纯度外泌体可用于核酸提取Westernblot、粒径分析、电镜检测等实验。CN113249302ACN113249302A权利要求书1/1页1.一种高效的外泌体分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤：S1.向体液中加入阳离子多聚物，在2‑10℃孵育5‑30min；S2.将体液混合物过滤后，截留物依次加入低浓度离液剂、高浓度离液剂进行洗脱，得到外泌体初分离物；S3.将外泌体初分离物中加入磁性吸附剂，在15‑35℃孵育2‑20min后，去除清液，取出磁性吸附剂；S4.向磁性吸附剂加入洗脱剂重悬，在15‑35℃孵育2‑20min后，取出清液，得到高纯度外泌体。2.根据权利要求1所述的一种高效的外泌体分离纯化方法，其特征在于：所述体液包括非人新生体的血液、血浆或血清。3.根据权利要求1所述的一种高效的外泌体分离纯化方法，其特征在于：S1中所述阳离子多聚物为多聚赖氨酸。4.根据权利要求3所述的一种高效的外泌体分离纯化方法，其特征在于：S2中采用孔径为0.1‑0.3μm滤膜过滤。5.根据权利要求1所述的一种高效的外泌体分离纯化方法，其特征在于：S2中所述低浓度离液剂为0.5‑2.5M异硫氰酸胍。6.根据权利要求1所述的一种高效的外泌体分离纯化方法，其特征在于：S2中所述高浓度离液剂为4‑6M异硫氰酸胍。7.根据权利要求1所述的一种高效的外泌体分离纯化方法，其特征在于：S3中所述磁性吸附剂为包裹有二氧化钛的磁珠。8.根据权利要求1所述的一种高效的外泌体分离纯化方法，其特征在于：S4中所述洗脱剂为浓度为5‑25%氨水。9.根据权利要求1所述的一种高效的外泌体分离纯化方法，其特征在于：S4中磁性吸附剂重悬前先用PBS漂洗。2CN113249302A说明书1/4页一种高效的外泌体分离纯化方法技术领域[0001]本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及一种高效的外泌体分离纯化方法。背景技术[0002]外泌体(Exosomes)是细胞经过"内吞‑融合‑外排"等一系列调控过程而形成的直径在30～150nm的圆形单层膜结构的细胞外小囊泡。外泌体由机体众多类型细胞释放，并广泛分布于唾液、血浆、乳汁、尿液等体液当中，可以携带蛋白，运送RNA，在细胞间物质和信息转导中起重要作用。外泌体的发现丰富了研究者们对细胞间通讯方式的认识，加深了对机体生理、病理过程的理解，2013年诺贝尔生物/医学奖授予了三位在细胞囊泡方面贡献突出的科学家，使外泌体的研究达到全新的高度。[0003]近年来，随着人们对外泌体的研究和认识加深，外泌体检测作为一种新型的液体活检热点技术已被许多临床科研机构广泛地应用于肿瘤和疾病的无创诊断、治疗和监测；如何高效地提取外泌体是实现这项新兴液体活检技术临床常规化应用的关键。外泌体作为液体活检的三大领域之一，其潜在的生物靶标众多，但能同时将微量核酸和蛋白，通常，为获取纯度高的外泌体，需要应用到外泌的分离技术。[0004]目前外泌体的分离技术有超速离心法、分子排阻法、免疫捕获法、PEG沉淀等方法。超速离心一般需要7小时以上，且耗时耗力、所需仪器设备昂贵，很难获得足够量的外泌体用于后续的实验分析；分子排阻法即免疫捕获法所收集的外泌体量少，且费用高昂；PEG沉淀法虽然可以大规模分离外泌体，但是在收集到大量外泌体的同时不可避免的引入脂蛋白，造成分离所得外泌体纯度低的问题。由于国内有关外泌体提取试剂的缺乏，我国对外泌体的研究还基本依赖于过程繁琐的超速离心