一种高效快速分离血浆外泌体的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111996165A(43)申请公布日2020.11.27(21)申请号202010739541.1(22)申请日2020.07.28(71)申请人周崧雯地址200433上海市杨浦区政民路507号上海市肺科医院肿瘤科(72)发明人周崧雯万小英邓沁芳谢博雄(74)专利代理机构北京盛凡智荣知识产权代理有限公司11616代理人尚欣(51)Int.Cl.C12N5/078(2010.01)权利要求书1页说明书5页(54)发明名称一种高效快速分离血浆外泌体的方法(57)摘要本发明公开了一种高效快速分离血浆外泌体的方法，包括以下步骤：步骤一：配制得亲水聚合物溶液；步骤二：稀释得稀释后的血浆；步骤三：离心去除血浆中的细胞成分得去除细胞的血浆；步骤四：进行超高速离心沉淀得沉淀外泌体；步骤五：使用磷酸缓冲盐溶液悬浮得悬浮的外泌体；步骤六：使用酚和硫氰酸胍的单相溶液得重新溶解的悬浮外泌体；步骤七：加入200μl氯仿并振荡15秒后得振荡后的外泌体溶液；步骤八：离心15分钟得分层的外泌体溶液；步骤九：吸取最上层的无色液体得上清层液体；步骤十：加入同等体积的异丙醇进行沉淀得高纯度的外泌体沉淀物。本发明属于生物技术技术领域，具体是一种操作简单、成本低、能够高效的分离和提纯外泌体的方法。CN111996165ACN111996165A权利要求书1/1页1.一种高效快速分离血浆外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：对聚乙二醇、硫酸葡聚糖、聚乙烯吡络烷酮配制得亲水聚合物溶液；步骤二：对血浆用亲水聚合物溶液稀释得稀释后的血浆；步骤三：对稀释后的血浆进行离心去除血浆中的细胞成分和细胞碎片得去除细胞的血浆；步骤四：对去除细胞的血浆进行超高速离心沉淀得沉淀外泌体；步骤五：对沉淀外泌体使用磷酸缓冲盐溶液悬浮得悬浮的外泌体；步骤六：对悬浮的外泌体使用酚和硫氰酸胍的单相溶液得重新溶解的悬浮外泌体；步骤七：对重新溶解的悬浮外泌体中加入200μl氯仿并振荡，振荡时间为15秒，振荡后得振荡后的外泌体溶液；步骤八：对振荡后的外泌体溶液以2000g的离心力进行离心，离心时间为15分钟并得分层的外泌体溶液；步骤九：对分层的外泌体吸取最上层的无色液体得上清层液体；步骤十：将与上清层液体同等体积的异丙醇加入到上清层液体中进行沉淀，沉淀后得高纯度的外泌体沉淀物。2.根据权利要求1所述的一种高效快速分离血浆外泌体的方法，其特征在于：所述步骤一中的聚乙二醇的分子量为2000～1200000道尔顿、硫酸葡聚糖的分子量为5000～20000道尔顿、聚乙烯吡络烷酮的分子量为40000～700000道尔顿。3.根据权利要求2所述的一种高效快速分离血浆外泌体的方法，其特征在于：所述步骤二中的亲水聚合物溶液位水溶液，所述亲水聚合物的总浓度为1-500mg/ml。4.根据权利要求3所述的一种高效快速分离血浆外泌体的方法，其特征在于：所述步骤三中的稀释后的血浆中血浆和亲水聚合物溶液的配比为1：1～2。5.根据权利要求4所述的一种高效快速分离血浆外泌体的方法，其特征在于：所述步骤三取稀释后的血浆以12000g的离心力进行离心，离心时间为30分钟。6.根据权利要求5所述的一种高效快速分离血浆外泌体的方法，其特征在于：所述步骤四中的稀释后的血浆以12000g的离心力进行，离心时间为30分钟，所述步骤四种去除细胞的血浆以110000g～160000g的离心力进行离心，离心时间为2小时。7.根据权利要求6所述的一种高效快速分离血浆外泌体的方法，其特征在于：所述步骤五中的酚和硫氰酸胍的单相溶液数量的取值范围为100μl～250μl。8.根据权利要求7所述的一种高效快速分离血浆外泌体的方法，其特征在于：所述步骤六中的悬浮的外泌体为每250μl加0.75ml酚和硫氰酸胍的单相溶液重新溶解悬浮的外泌体。9.根据权利要求8所述的一种高效快速分离血浆外泌体的方法，其特征在于：所述步骤七中的氯仿取值范围为150μl～250μl。2CN111996165A说明书1/5页一种高效快速分离血浆外泌体的方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体是指一种高效快速分离血浆外泌体的方法。背景技术[0002]外泌体是由细胞分泌而来具有杯状形态、双层膜结构的微小囊泡，外泌体天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中，甚至肿瘤细胞在内几乎所有类型的细胞如免疫细胞、神经细胞和干细胞等，都可以产生并释放外泌体，外泌体携带大量特异性的蛋白质以及功能性的mRNA、miRNA等生物活性物质，其主要功能为在细胞之间传递信息，并在多种生物状态与疾病中发挥着重要的生理病理学功能，包括肿瘤发生，血管生成，免疫抑制，转移等，这为疾病的检测提供了新的方向和方法。因此