一种造血干细胞分离纯化的方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113913381A(43)申请公布日2022.01.11(21)申请号202111257415.3(22)申请日2021.10.27(71)申请人广州市天河诺亚生物工程有限公司地址510000广东省广州市广州高新技术产业开发区南云四路1号(72)发明人魏伟嵐山芮张宗明(74)专利代理机构北京品源专利代理有限公司11332代理人赵颖(51)Int.Cl.C12N5/0789(2010.01)权利要求书2页说明书10页附图2页(54)发明名称一种造血干细胞分离纯化的方法及其应用(57)摘要本发明提供了一种造血干细胞分离纯化的方法及其应用，所述方法包括：将血液与生理盐水混合，加入分离液，离心分离；吸取白膜层细胞悬液，洗涤后离心；收集沉淀，进行冻存；复苏冻存后的细胞，培养，去除贴壁细胞，保留悬浮细胞，得到所述造血干细胞。所述造血干细胞分离纯化的方法操作简单，生产效率高而成本较低；制备得到的造血干细胞活性好，纯度高，增殖能力强，具有实际应用的价值。CN113913381ACN113913381A权利要求书1/2页1.一种造血干细胞分离纯化的方法，其特征在于，所述方法包括：将血液与生理盐水混合，加入分离液，离心分离；吸取白膜层细胞悬液，洗涤后离心；收集沉淀，进行冻存；复苏冻存后的细胞，培养，去除贴壁细胞，保留悬浮细胞，得到所述造血干细胞。2.根据权利要求1所述的造血干细胞分离纯化的方法，其特征在于，所述血液与生理盐水的体积比为1:(1～3)；优选地，所述分离液包括Ficoll淋巴细胞分离液；优选地，所述离心分离的时间为20～30min，所述离心分离的离心力为450～550g，所述离心分离的温度为18～25℃；优选地，所述离心分离的离心加速度为5～10，离心减速度为1～3。3.根据权利要求1或2所述的造血干细胞分离纯化的方法，其特征在于，所述洗涤包括一次洗涤和二次洗涤。4.根据权利要求3所述的造血干细胞分离纯化的方法，其特征在于，所述一次洗涤使用的洗涤液为生理盐水，所述白膜层细胞悬液与生理盐水的体积比为1:(2～5)；优选地，所述一次洗涤后所述离心的离心力为550～650g，所述离心的时间为8～12min；优选地，所述二次洗涤使用的洗涤液为含人血清白蛋白的PBS溶液，所述人血清白蛋白的浓度为0.8％～1.5％，优选为1％；优选地，所述二次洗涤后所述离心的离心力为150～250g，所述离心的时间为8～12min。5.根据权利要求1～4任一项所述的造血干细胞分离纯化的方法，其特征在于，所述冻存的步骤包括：向沉淀中加入冻存保护剂，通过程序控制进行降温，再进行冻存；优选地，所述冻存保护剂为二甲基亚砜和低分子右旋糖苷的组合物，所述二甲基亚砜和低分子右旋糖苷的体积比为1:(0.8～2)，优选为1:1。6.根据权利要求1～5任一项所述的造血干细胞分离纯化的方法，其特征在于，所述复苏的温度为36.5～37.5℃；优选地，所述培养使用的培养基包括RPMI1640培养基，所述培养在含二氧化碳的条件下进行，所述培养的时间为18～24h。7.根据权利要求1～6任一项所述的造血干细胞分离纯化的方法，其特征在于，所述方法还包括对所述造血干细胞进行扩增培养的步骤；优选地，所述扩增培养的步骤包括：向扩增培养基中接种造血干细胞，每间隔2～4天补充扩增培养基，培养8～12天，使用生理盐水洗涤2～3次，收集细胞；优选地，所述接种的密度为(3～8)×104个/mL。8.根据权利要求1～7任一项所述的造血干细胞分离纯化的方法，其特征在于，所述扩增培养基包括：体积分数为13％～18％的脐血浆、质量分数为0.02％～0.05％的低分子肝素钙、15～25ng/mLIL‑6、15～25ng/mLIL‑3、45～55ng/mLSCF、45～55ng/mLFlt‑3L和152CN113913381A权利要求书2/2页～25ng/mLTPO。9.根据权利要求1～8任一项所述的造血干细胞分离纯化的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)离心分离：将血液与生理盐水按体积比为1:(1～3)混合，加入Ficoll淋巴细胞分离液，在18～25℃下，以450～550g、离心加速度为5～10、离心减速度为1～3的条件离心分离20～30min；(2)收集白膜层细胞：吸取白膜层细胞悬液，与生理盐水按体积比为1:(2～5)混合，一次洗涤后，在550～650g下离心8～12min；收集细胞，使用含浓度为0.8％～1.5％人血清白蛋白的PBS溶液二次洗涤后，以150～250g离心8～12min；(3)冻存细胞：收集沉淀，向沉淀中加入冻存保护剂，通过程序控制进行降温，再进行冻存；所述冻干保护剂为二甲基亚砜和低分子右旋糖苷按体积比为1:(0.8～