一种mRNA工业化分离纯化方法及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115287282A(43)申请公布日2022.11.04(21)申请号202210893586.3(22)申请日2022.07.27(71)申请人苏州纳微科技股份有限公司地址215026江苏省苏州市工业园区百川街2号申请人常熟纳微生物科技有限公司(72)发明人金百胜夏平安陈阳雪王程(74)专利代理机构北京品源专利代理有限公司11332专利代理师赵颖(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)权利要求书2页说明书8页附图2页(54)发明名称一种mRNA工业化分离纯化方法及其应用(57)摘要本发明提供一种mRNA工业化分离纯化方法及其应用，所述mRNA工业化分离纯化方法包括以下步骤：将mRNAIVT反应液依次进行亲和层析和疏水层析处理，得到纯化的mRNA。本发明将亲和层析和疏水层析两步法纯化工艺用于mRNA产品的纯化，不仅操作简便易放大，减少了操作步骤，同时提高了纯化mRNA的总回收率，并符合药用标准。CN115287282ACN115287282A权利要求书1/2页1.一种mRNA工业化分离纯化方法，其特征在于，所述mRNA工业化分离纯化方法包括以下步骤：将mRNAIVT反应液依次进行亲和层析和疏水层析处理，得到纯化的mRNA。2.根据权利要求1所述的mRNA工业化分离纯化方法，其特征在于，所述亲和层析采用的亲和层析填料包括NanoGeldT20；优选地，所述疏水层析采用的疏水层析填料包括UniHRButyl30L。3.根据权利要求1或2所述的mRNA工业化分离纯化方法，其特征在于，所述mRNA工业化分离纯化方法具体包括以下步骤：(1)将mRNAIVT反应液上样至平衡后的亲和层析柱中，然后使用洗杂缓冲液进行洗杂，使用洗脱缓冲液进行洗脱，收集第一洗脱液；(2)将步骤(1)得到的第一洗脱液上样至平衡后的疏水层析柱中，然后使用洗杂缓冲液进行洗杂，使用洗脱缓冲液进行洗脱，收集第二洗脱液。4.根据权利要求3所述的mRNA工业化分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述亲和层析柱采用4‑6个柱体积的平衡缓冲液进行平衡；优选地，所述平衡缓冲液按摩尔浓度计包括8‑12mMTris‑HCl、0.3‑0.7MNaCl和0.8‑1.2mMEDTA，pH为7.2‑7.7，溶剂为水。5.根据权利要求3或4所述的mRNA工业化分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述洗杂缓冲液按摩尔浓度计包括8‑12mMTris‑HCl、0.3‑0.7MNaCl和0.8‑1.2mMEDTA，pH为7.2‑7.7，溶剂为水；优选地，步骤(1)中，使用4‑6个柱体积的洗杂缓冲液冲进行洗杂；优选地，步骤(1)中，所述洗脱缓冲液包括去离子水；优选地，步骤(1)中，使用4‑6个柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。6.根据权利要求3‑5中任一项所述的mRNA工业化分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述疏水层析柱采用4‑6个柱体积的平衡缓冲液进行平衡；优选地，所述平衡缓冲液按摩尔浓度计包括1.2‑1.8M硫酸铵和45‑55mMTris‑HCl，pH为7‑7.4，溶剂为水。7.根据权利要求3‑6中任一项所述的mRNA工业化分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述洗杂缓冲液按摩尔浓度计包括1.2‑1.8M硫酸铵和45‑55mMTris‑HCl，pH为7‑7.4，溶剂为水；优选地，步骤(2)中，使用4‑6个柱体积的洗杂缓冲液进行洗杂。8.根据权利要求3‑7中任一项所述的mRNA工业化分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述洗脱缓冲液包括第一洗脱缓冲液和第二洗脱缓冲液；优选地，所述第一洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括1.2‑1.8M硫酸铵和45‑55mMTris‑HCl，pH为7‑7.4，溶剂为水；优选地，所述第二洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括48‑52mMTris‑HCl，pH为7‑7.4，溶剂为水；优选地，步骤(2)中，所述洗脱包括依次进行地第一洗脱和第二洗脱；优选地，所述第一洗脱为线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱采用第一洗脱缓冲液和/或第二洗脱缓冲液进行洗脱，所述线性梯度洗脱过程中第二洗脱缓冲液和第一洗脱缓冲液的体积分数比为0％:100％→100％:0％；2CN115287282A权利要求书2/2页优选地，所述第一洗脱采用12‑17个柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱；优选地，所述第二洗脱采用第二洗脱缓冲液进行洗脱；优选地，所述第二洗脱采用3‑7个柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。9.根据权利要求3‑8中任一项所述的mRNA工业化分离纯化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将mRNAIVT反应液上样至平衡后的亲和层析柱中，然后使用洗杂缓冲液进行洗杂，使用洗脱缓冲液进行洗脱，收集第一洗脱液；其中，所述亲和层析柱采用4