造血干细胞表型及分离纯化方法.pptx

会计学支持干细胞存在的初始证据3.用带有新霉素抗性基因标志的逆转
录病毒载体转染鼠骨髓细胞，分析
病毒特异聚集部位证实，不同淋巴
和髓系表型的细胞来自同一干细
胞。
4.鼠胎肝造血祖细胞体外单细胞培养
可生成髓系和粒系细胞。缺乏辨认、计数干细胞的手段。干细胞的辨认仅靠体外克隆形成分析和估算如：CFU-GM，CFU-Mix。Civin等制备出一株鼠抗人髓系白血病细胞单抗(My-10),当时称KG-la,该抗体可与所有造血前体细胞(progenitors)特异结合。之后，其他研究小组也相继研制出12.8;BI-3c5;ICH-3等类似抗体。1986年，这些抗体被命名为CD34，为目前公认的干细胞的重要标志。
CD34抗原的发现促进了造血干细胞研究的深入和发展，是一重要的里程碑事件。
一.造血细胞的表型
CD34；Sca-1；Thy-1；Lin-；c-kit
二.造血细胞分离方法
FACS；磁柱分离；亲合分离；
Panning一、造血干细胞表型1.CD34的生物学特性全长(spans)26~28kb(human),编码序列含8个exons，第1和8个exon编码翻译区和部分非翻译区；2~7个exons仅编码翻译区。也有报道人CD34基因全长38kb。在cytoplasmicdomains,人、鼠CD34基因的同源性达90%以上。这种同源性在N末端逐渐减少为45%左右。分子量为105-120kd。人CD34cDNA转录翻译的多肽链长373个氨基酸残基，是一跨膜蛋白。N端为20aa的信号肽，含有大量的serine/threonine；胞外区258aa；跨膜区22aa；胞内区73aa。所谓表位是指同一抗原分子上有不同的抗原识别位点。目前有My-10,BI-3c5,12.8,ICH-3,TUK,115.2等单抗识别的位点。前四株识别的表位取决于sialicacidresidues,后二者却不一样。（根据对neuraminidase和glycopotease的敏感性不同）此外，淋巴内皮小静脉粘附实验表明，由重组L-selectin识别的一种内皮糖蛋白的硫化碳水化合物，其氨基酸的序列与CD34一致，因此，CD34分子至少可作为L-selectin的配体，协助干细胞与基质细胞接触和粘附。
干细胞越原始，表面CD34分子密度越大，细胞分化到形态学发生改变时，表面CD34分子表达逐渐减少，直至消失。
推测，在造血早期，CD34分子的作用可能与干细胞之间或干细胞与基质细胞之间的接触、通信和相互作用有关。Civin小组证实，CD34可由激活的PKC迅速磷酸化，激活的PKC能刺激CD34阳性前体细胞CD34上调，这种上调独立于内质网内CD34的转录和转换。可见，CD34磷酸化是细胞表面上调的扳机，PKC活化是生长因子配体-受体结合启动胞浆信号转导级联的一个成分。外周血单核细胞约为0.1%
破骨细胞(osteoclasts)、骨髓基质前体
细胞、外周神经鞘细胞、成纤维细胞、
血管内皮细胞等也发现有CD34抗原表
达。
骨髓单核细胞约为1~3%。
一些恶性疾病，如AML、早前，前和急性T淋巴细胞白血病细胞都有CD34抗原的表达。在成人AML中，外周细胞CD34的表达预示患者对系统治疗反应较差，完全缓解率及存活率低，传统的化疗方案治疗效果可能不好。
根据细胞表面抗原表达的情况，可将CD34阳性细胞分为许多亚群，这些细胞多数已定向到特定细胞系。
与CD34共表达，可作为干细胞进一步分型依据的抗原有：CD38、CD10、CD19、CD5、CD7、CD71、CD45、CD41、CD13、CD33等。不同CD34阳性细胞亚群CD34hiLin-HLA-DRlowThy-1+CD45RO+Rhodull…………..CD34+CD38-HLA-DR+和CD34+CD38-HLA-DR-两群细胞，前者克隆率为50%，能向所有造血细胞系分化；后者除前者功能外，还能形成复杂的，能支持造血前体细胞分化的基质结构，这种细胞被命名为Common(hematopoietic/stromal)StemCell(CSC)。Osawa等人首先证明小鼠HSCs可以是
CD34阴性的。
人的CD34阴性细胞也有低水平的造血能
力。
移植研究表明胎绵羊CD34阴性细胞有重
新繁殖的能力。
人和鼠的CD34阳性细胞可能来源于
CD34阴性细胞。这些报告提示，HSCs可能是CD34+或CD34-。只选择表达CD34的细胞可能导致将更原始的干细胞排除在外。然而几乎所有的临床和实验流程包括体外培养、基因疗法和HSC抑制，目前都设计成收集富含CD34+的细胞。(二)干细胞其它免疫表型从前T细胞杂交瘤中得到的几株单抗，由此单抗识别的抗原被命名为Sca-1。是18kDa磷脂酰肌醇锚定蛋白，属Ly-6抗原家族成员。