一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115141813A(43)申请公布日2022.10.04(21)申请号202210907674.4(22)申请日2022.07.29(71)申请人深圳源兴基因技术有限公司地址518055广东省深圳市南山区西丽街道松坪山社区松坪山路1号源兴科技大厦南座1521(72)发明人肖永强王三刚陈丽婷(74)专利代理机构北京市浩东律师事务所11499专利代理师孙莉(51)Int.Cl.C12N7/02(2006.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图4页(54)发明名称一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法(57)摘要本发明公开了一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法，适用于腺病毒的纯化生产。该纯化工艺包括下述步骤：病毒收获液经过Tween‑80裂解以及核酸酶处理后，接着使用深层过滤器和膜过滤器对病毒收获液进行澄清处理，然后使用中空纤维柱对澄清液进行浓缩和洗滤，之后分别用Source30Q阴离子交换层析填料和CaptoQ阴离子交换层析填料对溶液进行精纯，最后使用Sepharose4FastFlow层析填料对离子交换收获液进行进一步纯化以及置换保存液，经除菌过滤后，获得原液。该纯化方法采用了两种滤器进行澄清处理除去了大部分的宿主细胞蛋白(HCP)，以及在精纯过程中采取了两步离子交换层析，可进一步除去残留的HCP，纯化获得合格的原液，其HCP残留量小于100ng/1×1011VP。CN115141813ACN115141813A权利要求书1/1页1.一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法，其特征在于：该腺病毒纯化方法包括下述步骤，S1.细胞裂解，病毒收获液经过Tween‑80裂解以及核酸酶处理；S2.澄清浓缩，使用深层过滤器和膜过滤器对病毒收获液进行澄清处理，然后使用中空纤维柱对澄清液进行浓缩和洗滤；S3.精纯，分别用Source30Q阴离子交换层析填料和CaptoQ阴离子交换层析填料对溶液进行精纯；S4.置换除菌，使用Sepharose4FastFlow层析填料对离子交换收获液进行进一步纯化以及置换保存液，经除菌过滤后，获得原液。2.根据权利要求1所述的一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法，其特征在于：细胞裂解条件是使用0.5％Tween‑80于37℃裂解2h，然后加入浓度为20U/ml的核酸酶继续处理3小时，再用添加终浓度为300mM的NaCl终止酶切30min。3.根据权利要求1所述的一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法，其特征在于：膜过滤器规格为0.5/0.2μm。4.根据权利要求1所述的一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法，其特征在于：中空纤维柱孔径为300kDa。5.根据权利要求1所述的一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法，其特征在于：洗滤处理过程中采用A液，所使用的A液体系为50mMTris‑HCl，2mMMgCl2(pH8.0)，洗滤次数大于或等于3次。6.根据权利要求1所述的一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法，其特征在于：Source30Q阴离子交换层析包括下述条件，样品预处理需将洗滤后的样品补加B液至终浓度为30％B液，B液体系为1MNaCl，50mMTris‑HCl，2mMMgCl2(pH8.0)，上样：控制载量5×1011～1.5×1012VP/ml填料，流速：30cm/h，洗脱：流速45cm/h，30％B液清洗柱床2～4CV；30％～60％B液梯度洗脱，洗脱体积为4～6CV，收集目的峰。7.根据权利要求6所述的一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法，其特征在于：CaptoQ阴离子交换层析包括下述条件，上样样品为权利要求6所获得离子交换收获液直接上样，流速：20～50cm/h，洗脱：流速30cm/h，35％B液清洗柱床2～4CV；50％B液洗脱，收集目的峰。8.根据权利要求1所述的一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法，其特征在于：Sepharose4FastFlow层析填料对离子交换收获液进行进一步纯化以及置换保存液，其保存液体系为：10mMTris，75mMNaCl，5％Sucrose，1mMMgCl2，10mML‑Histidine，0.5％无水乙醇，0.01％Tween80，pH7.5。9.根据权利要求1所述的一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法，其特征在于：最后样品需经过0.2μm囊式滤器除菌过滤，获得原液，原液冻存于‑80℃冰箱。2CN115141813A说明书1/5页一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法技术领域[0001]本发明属于病毒纯化技术技术领域，具体涉及一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法。背景技术[0002