用于产生目标核酸分子的方法和组合物.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110573627A(43)申请公布日2019.12.13(21)申请号201880012969.7(74)专利代理机构北京国昊天诚知识产权代理(22)申请日2018.02.20有限公司11315代理人南霆程爽(30)优先权数据10-2017-00221672017.02.20KR(51)Int.Cl.C12Q1/6806(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日2019.08.20(86)PCT国际申请的申请数据PCT/KR2018/0020492018.02.20(87)PCT国际申请的公布数据WO2018/151574KO2018.08.23(71)申请人塞勒密斯株式会社地址韩国首尔申请人首尔大学校产学协力团(72)发明人权圣勋金廷玟卢珍星廉熹兰权利要求书2页说明书7页柳兑勋序列表6页附图4页(54)发明名称用于产生目标核酸分子的方法和组合物(57)摘要本申请提供一种产生目标核酸分子的方法，包含：(a)提供双链核酸分子，其包括目标序列区域、与目标序列区域的5’端连接且含有一个或多个脱氨碱基的第一侧翼序列区域和与目标序列区域的3’端连接的第二侧翼序列区域；(b)孵育核酸分子和对脱氨碱基具特异性的核酸内切酶，以去除范围从最靠近目标序列区域的5’端的脱氨碱基到核酸分子的5’端的第一侧翼序列区域。本申请还提供用于产生目标核酸分子的组合物，所述目标核酸分子包括双链核酸分子和对脱氨碱基具特异性的核酸内切酶。CN110573627ACN110573627A权利要求书1/2页1.一种用于产生目标核酸分子的方法，包含：(a)提供双链核酸分子，其包括目标序列区域、与所述目标序列区域的5’端连接并含有一个或多个脱氨碱基的第一侧翼序列区域和与所述目标序列区域的3’端连接的第二侧翼序列区域；和(b)孵育所述核酸分子和对脱氨碱基具特异性的核酸内切酶，以去除范围从最靠近所述目标序列区域的5’端的脱氨碱基到所述核酸分子的5’端的第一侧翼序列区域。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述双链核酸分子是通过扩增模板核酸分子所获得的产物，所述模板核酸分子包含所述目标序列区域、与所述目标序列区域的5’端连接的第三侧翼序列区域和与所述目标序列区域的3’端连接的第四侧翼序列区域，所述目标序列区域的3’端具有含有一个或多个脱氨碱基并黏接到所述第四侧翼序列区域的引物组；以及所述模板核酸分子通过基于微阵列的合成制备。3.根据权利要求1所述的方法，其中一个或多个核苷酸排列在相邻的脱氨碱基之间。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述脱氨碱基是肌苷碱基或尿嘧啶碱基。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述脱氨碱基是肌苷碱基，并且所述肌苷特异性核酸内切酶是核酸内切酶V。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述肌苷特异性核酸内切酶是源自海栖热袍菌或大肠杆菌的核酸内切酶V。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述脱氨碱基是尿嘧啶碱基，并且所述尿嘧啶特异性核酸内切酶是尿嘧啶特异性切除试剂(USER)。8.根据权利要求1所述的方法，其中3至8个核苷酸排列在相邻的肌苷碱基之间。9.根据权利要求1所述的方法，还包括(c)孵育不含所述第一侧翼序列区域的核酸分子和3'→5'核酸外切酶以除去单链第二侧翼序列区域。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述核酸外切酶是T4DNA聚合酶。11.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(b)和(c)通过一步法进行，并且包含所述双链核酸分子、所述脱氨碱基特异性核酸内切酶和所述核酸外切酶的反应物在36℃至65℃孵育，然后在20℃至30℃孵育。12.一种用于产生目标核酸分子的组合物，其包含：双链核酸分子，其包括目标序列区域、与所述目标序列区域的5’端连接且含有一个或多个脱氨碱基的第一侧翼序列区域和与所述目标序列区域的3’端连接的第二侧翼序列区域；和对所述脱氨碱基具特异性的核酸内切酶。13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述双链核酸分子是通过扩增模板核酸分子所获得的产物，所述模板核酸分子包含所述目标序列区域、与所述目标序列区域的5’端连接的第三侧翼序列区域和与所述目标序列区域的3’端连接的第四侧翼序列区域，所述目标序列区域的3’端具有含有一个或多个脱氨碱基并黏接到所述第四侧翼序列区域的引物组；以及所述模板核酸分子通过基于微阵列的合成制备。14.根据权利要求12所述的组合物，其中一个或多个核苷酸排列在所述双链核酸分子中的相邻脱氨碱基之间。15.根据权利要求12所述的组合物，其中所述脱氨碱基是肌苷碱基或尿嘧啶碱基。16.根据权利要求12所述的组合物，其中所述脱氨碱基是肌苷碱基，并且所述脱氨碱基特异性核酸内切酶是核酸内切酶V。2CN110573627A权利要求书2/2页17.根据权利要求1