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本发明提出用于低血浆起始量、低频突变检测的方法、试剂盒及其应用,其中,包括一种高通量测序文库的构建方法:1)对提取后cfDNA进行末端修复;2)对末端修复产物进行接头连接;3)对接头连接产物进行第一次磁珠纯化;4)对第一纯化产物进行扩增得到扩增产物;5)对扩增产物进行第二次磁珠纯化得到预文库;6)利用所述单个预文库进行混合处理;7)利用步骤6)获得的混合预文库配置杂交反应体系,并进行杂交处理;8)将步骤7)获得的杂交产物进行特异性捕获,以便获得捕获文库;9)将所述捕获文库进行扩增及第三次磁珠纯化处理,得到包含所述样品基因组DNA中突变频率不低于0.3%的DNA片段的所述高通量测序文库。