最新精编医学专题—流式细胞术的原理和应用.ppt

细胞因子及免疫细胞功能检测(jiǎncè)方法简介内容一、免疫学检测(jiǎncè)的基本原理第四页共一百一十五页。二、细胞因子检测(jiǎncè)方法（一）细胞因子的临床意义（二）常规检测(jiǎncè)方法1.分子生物学测定法分子杂交(zájiāo)技术多聚酶链反应技术(jìshù)（PCR）PCR原理(yuánlǐ)反转录(zhuǎnlù)PCR（ReversetranscriptionPCRRT-PCR)RTRT-PCR反应(fǎnyìng)过程RT反应(fǎnyìng)体系PCR反应(fǎnyìng)体系RT-PCR反应(fǎnyìng)产物检测实时荧光(yíngguāng)定量PCR(FluorescenceQuantifiedrealtimePCR)（1）原理(yuánlǐ)1)常用名词(míngcí)概念扩增曲线(qūxiàn)设定(shèdìnɡ)荧光域值荧光(yíngguāng)阈值（threshold）Ct值Ct值的确定(quèdìng)Ct值与起始(qǐshǐ)模板的关系（2）常用(chánɡyònɡ)标记方法SYBRGreenI染料(rǎnliào)法SYBRGreenI染料(rǎnliào)法原理注意事项结果判定(pàndìng)——融解曲线第三十三页共一百一十五页。（3）qPCR结果分析——相对(xiāngduì)定量解析1）相对(xiāngduì)定量的必要性必须用内对照(duìzhào)基因（管家基因）进行校正2）管家基因筛选(shāixuǎn)3）分析方法1）双标准(biāozhǔn)曲线法第四十页共一百一十五页。优缺点2）2-△△Ct法2-△△Ct法：假设目的基因、对照基因扩增效率均是100%△Ct（处理前/对照组）=18-17=1△Ct（处理后/实验组）=16-17.4=-1.4△△Ct=△Ct（处理后）-△Ct（处理前)=-2.4比率(bǐlǜ)（处理后/处理前）=2-△△Ct=2--2.4=5.3结论：JUN处理后表达水平是处理前的5.3倍修正：扩增效率不是1而是E2-△△Ct可修正为（1+E）-△△Ct优点(yōudiǎn)2.生物(shēngwù)活性检测法（1）依赖性细胞株（2）功能(gōngnéng)检测A.增殖(zēngzhí)或增殖(zēngzhí)抑制法B.集落形成(xíngchéng)法C.直接(zhíjiē)杀伤靶细胞D.抗病毒效应(xiàoyìng)E.趋化作用(zuòyòng)F.抗体(kàngtǐ)形成法一般(yībān)方法对生物学活性测定法的评价(píngjià)3.免疫化学测定法60（三）胞内细胞因子检测(jiǎncè)方法活化剂人外周血单个核细胞IL-17A流式检测(jiǎncè)方法图1.表达IL-17和IFN-的CD4+T细胞(xìbāo)分析（四）细胞因子检测(jiǎncè)的临床应用三、常用免疫(miǎnyì)细胞功能检测方法内容(nèiróng)（一）淋巴细胞功能(gōngnéng)检测淋巴细胞1.T细胞(xìbāo)功能检测（1）T淋巴细胞增殖(zēngzhí)试验未转化和转化淋巴细胞的形态特征第七十六页共一百一十五页。B.刺激物T细胞(xìbāo)常用(chánɡyònɡ)方法形态(xíngtài)计数法方法(fāngfǎ)评价同位素掺入法SI＝PHA刺激管cpm均值(jūnzhí)/对照管cpm均值CCK8法(CellCountingKit8)(2)T细胞分泌(fēnmì)功能测定(3)T细胞(xìbāo)介导的细胞(xìbāo)毒实验A.原理(yuánlǐ)：形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞计数残留肿瘤细胞同位素法：淋巴细胞（CTL）+含51Cr的肿瘤细胞肿瘤细胞破坏51Cr释放测定(cèdìng)γ射线（4）体内(tǐnèi)试验2.B细胞(xìbāo)功能检测(1)B细胞(xìbāo)增殖能力检测（2）体外抗体(kàngtǐ)形成细胞检测溶血(rónɡxuè)空斑试验原理(yuánlǐ)B细胞抗体(kàngtǐ)形成功能的检测——酶联免疫斑点法(4)体内(tǐnèi)实验（二）吞噬细胞功能(gōngnéng)检测1.中性(zhōngxìng)粒细胞的功能检测(1)细胞(xìbāo)运动功能——趋化功能检测方法(fāngfǎ)：(2)吞噬和杀菌功能(gōngnéng)测定NBT还原(huányuán)试验2、巨噬细胞功能(gōngnéng)检测（2）吞噬(tūnshì)功能检测（3）巨噬细