9第9章酶免疫技术教程文件.ppt

第九章酶免疫技术第二节酶免疫技术的分类
一、均相酶免疫测定
二、非均相酶免疫测定
第三节酶联免疫吸附试验
一、基本原理
二、方法类型及反应原理放射免疫技术主要试剂:
酶标记的抗体或抗原
酶标物特点：
免疫学活性
酶对底物的催化活性特点：
灵敏度高、特异性强、准确性好
酶标记试剂能够较长时间保持稳定
操作简便、对环境没有污染。
易与其它技术偶联
衍生出适用范围更广的新方法。标记酶的要求：
活性高
性质稳定
专一性强
酶催化底物的显色信号易于判断和测量
方法敏感，重复性好，简单易行
酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉
辣根过氧化物酶（HRP）优点
碱性磷酸酶（AP）
HRP的底物HRP的常见底物OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。AP的
底物酶免疫技术的核心组成部分抗原要求纯度高，抗原性完整制备方法要求制备方法戊二醛交联法纯化及鉴定固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法要求将抗原或抗体结合于固相载体第二节酶免疫技术分类用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定最具代表性的两种技术EMIT示意图CEDIA示意图分类：液相酶免疫测定
固相酶免疫测定
以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前最为常用的固相酶免疫测定第三节酶联免疫吸附试验固相的抗原或抗体双抗体夹心法

方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色

应用：
二价或二价以上的较大分子抗原测定
乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等竞争法方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）洗涤双抗原夹心法
原理：类似双抗体夹心法
操作步骤：类似
应用：乙型肝炎表面抗体竞争法
原理：类似检测抗原的竞争法

应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测捕获法
应用：
病原体急性感染诊断中的IgM型抗体

甲型肝炎HAV-IgM抗体

乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体捕获法第四节酶免疫测定的应用均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。非均相免疫测定中的ELISA应用更为广泛，ELISA广泛用于传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如结核杆菌、幽门螺杆菌等。也用于一些蛋白质检测，如各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）。1．酶免疫技术的要点？
2．酶联免疫吸附试验的原理（ELISA）？
3．竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？
4．常用的底物有哪几类？特点？
5．常用的酶有哪几类？特点？
6．何谓包被与封闭？其作用？
7．常用固相载体的种类和特点？
8．举例固相酶免疫测定应用的原理及影响因素。
9．ELISA的非特异性干扰有哪些，其机制？
10．对酶免疫技术的应用评价如何？酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底物的作用进一步提高敏感性。酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两大类,后者根据抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型。
均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原的测定，非均相酶免疫测定根据是否使用固相支持物，又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。最常用的是以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）,其原理可以有夹心法、竞争法、间接法和捕获法等。