免疫标记技术-节酶免疫技术.ppt

免疫标记技术,节酶免疫技术第十六章酶免疫技术目录前言第一节酶标志物的制备1.辣根过氧化物酶（HRP）HRP的底物OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。2.碱性磷酸酶
二、制备酶标记抗体(抗原）的方法三、酶标记物的纯化与鉴定四、固相载体（二）固相载体的种类第二节酶联免疫吸附试验二、ELISA的方法类型如果血清标本中含有类风湿因子（RF），则可出现假阳性反应。因为类风湿因子是一种抗变性IgG的自身抗体，它可同时与固相抗体和酶标抗体的Fc段发生结合，导致假阳性的出现。（二）双位点一步法E如果待检标本中抗原浓度过高，容易形成“钩状效应（hookeffect）”。钩状效应严重时，可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。（三）间接法此法由于受血清中高浓度非特异性IgG的干扰，通常要将待测标本进行一定稀释后才能测定。（四）竞争法待测抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与待测抗原的量呈反比，待测抗原越多，其结合特异性抗体越多，而酶标抗原与特异性抗体结合就减少，底物显色反应浅；显色越深，待测抗原量则越少。竞争法主要用于检测小分子抗原，因小分子抗原只有一个抗原决定簇。竞争法检测抗体1.竞争法检测HBcAb：
先将HBcAg包被在固相载体上，形成固相抗原，之后加入待测样本和酶标的特异抗体，待测样本的抗体将与酶标抗体竞争与固相载体上的特异抗原结合，温育后洗涤，加入酶底物显色，显色的强弱与待测抗体的含量成反比。2.竞争法检测HBeAb：
先将HBeAb包被在固相载体上，形成固相抗体，同时加入待测样本和中和抗原HBeAg，待测样本的抗体将与固相抗体竞争与中和抗原HBeAg结合。加入酶标的特异抗体，再加入酶底物，则显色的强弱与待测样本中的相应抗体的含量成反比。(五)捕获法在应用此法时需注意RF(IgM类)及其他非特异IgM的干扰。RF(IgM类)既能与固相载体上的IgM第二抗体结合，又能与随后加入的酶标抗体结合，从而导致假阳性结果。三、ELISA的关键技术（二）最适工作浓度的选择（三）测定方法的标准化四、评价与应用应用第三节其他酶免疫技术酶扩大免疫分析技术示意图克隆酶供体免疫分析示意图液相酶免疫技术是非均相酶免疫技术的方法类型之一，因抗原抗体反应在液相中进行而得名。其依据样品抗原加样顺序和温育反应时相不同可分为平衡法和非平衡法两种类型。三、斑点酶免疫吸附试验四、斑点酶免疫渗滤试验五、免疫印迹试验（一）生物素和亲和素的特点常用的方法有三种：BA法
BAB法
ABC法
小结