免疫酶技术.ppt

免疫酶技术概述：
70年代初在免疫荧光技术基础上建立。
较IF、RIA(radioimmunoassay)更优越,
具有敏感、安全、稳定、易观察结果等优点原理：
利用酶标记Ag或Ab后不改变Ag、Ab反应特异性，同时又不影响酶的活性，结合在AgAb上的酶催化底物，生成有色产物，根据产物颜色深浅推测出待测物中相应物质（Ab、Ag)有无及含量多少。
Ag+AbEAgAbE
+底物
呈色反应
免疫酶技术具有
特异性—Ag、Ab反应
敏感性—酶的高效催化作用两种方法:常用的酶
（一）选择酶的要求
1.自然界存在广，易获得
2.易纯化、性稳、活力高
3.形成的酶结合物稳定，并保留酶、抗体或抗原的活性4.底物来源方便并易保存
5.反应后有色产物能快速测定
6.酶分子量不能太大，太大不易进入组织细胞内，影响组化染色定位（二）常用的酶
辣根过氧化物酶
碱性磷酸酶
葡萄糖氧化酶等辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase,HRP)
一种铁卟啉蛋白质，分子量4.4万，能进入细胞内
酶活性强，酶结合物可长期保存
最适pH为5.5左右选用时注意酶纯度和活性
纯度：RZ表示，反映酶含量与蛋白含量之比，最好要RZ值为3.0左右
活性：每1mg酶中所具有的活性单位，应大于250u/mgHRP的底物：
邻苯二胺(OPD),四甲基联苯胺（TMB）
反应体系中作为供氢体

DH2+H2O2D+2H2O
供氢体受氢体有色产物OPD特点：
有色产物为黄色
空白对照接近无色
敏感度高，有致癌作用
TMB特点：
有色产物为蓝色
无致癌作用
底物系统（包括供氢体、受氢体）

临用时配，配后避光保存酶联免疫吸附实验
（Enzyme-Linkedimmunosorbentassay）
ELISA一.原理：
将酶分子与Ab或Ag连接成一酶结合物（酶标记物），当它与固相载体中相应Ag或Ab相遇，形成酶标记的AgAb复合物，加入底物，酶催化底物，生成有色产物，根据颜色深浅可测出溶液中Ag或Ab的量。固相载体实验中所需酶标抗体的制备方法同荧光抗体制备：
纯化后的抗体+酶透析去除游离酶测定酶标抗体工作浓度试验中有关术语及试剂：
包被(coat)：将Ag或Ab吸附在固相载体上的过程，又称固相化或吸附。包被后，不能被洗脱。包被缓冲液：PH9.6CB
洗涤(wash)：PH7.2-7.4PBS
酶结合物：酶标抗体或酶标抗原
终止液：2MH2SO4OPD：
HRP催化后其有色产物为黄色，H2SO4终止后变为橙色（棕色）。

TMB：
HRP催化后其有色产物为蓝色，H2SO4终止后变为黄色二.方法类型和操作步骤
（一）双抗体夹心法双抗体夹心法步骤：
包被已知Ab洗涤加待测标本（测Ag？）洗涤加酶标Ab洗涤加底物
加终止液观察结果双抗体夹心法的基本实验过程该法主要用于检测抗原
包被的抗体与酶标抗体属同一种类抗体
每检测一种抗原就需制备相应的酶标抗体，较麻烦（二）间接法测抗体步骤：
包被已知Ag＋待测标本（测Ab？）
——反应一段时间后，洗涤——加酶标抗抗体（酶标羊抗人IgG）——洗涤——加底物——加终止液，观察结果。该法主要用于测抗体
酶标记一种抗抗体可以用于多种抗
体的检测（三）双位点一步法步骤：包被抗体A＋待测标本
＋酶标抗体B
——洗涤，＋底物——终止液，观察结果

（检测Ag，Ag至少含A、B两个抗原表位）该法是一次性加入标本和酶标抗体，试验程序简单，提高了检测的特异性
用于检测Ag,且Ag是具有至少2种抗原表位的多价抗原
反应系统中固相Ab与酶标Ab的量相对于待测Ag是过量的，因此复合物的形成量与待测Ag含量成正比（在方法可检测范围内）（四）竞争法步骤：
待测管：已知Ab包被＋待测标本（Ag？）——洗涤，＋酶标Ag——洗涤，＋底物——显色

先加（五）应用亲和素和生物
素的ELISA亲和素(avidin)：糖蛋白，一分子由四个亚基组成，每一亚基可以与一分子生物素结合
生物素(biotin)：维生素H，可与蛋白质、糖类、酶类等结合，与亲和素特异结合后极稳定亲和素—生物素在ELISA中使用：
三.ELISA结果的判定
（一）肉眼判定
与阳性、阴性对照颜色比较：结果判定（二）酶标光度仪检测A492值
（吸光率）：比色法
1.与阳性、阴性对照测定值比较
2.P/N比值：大于2.0为阳性，小于2.0
为阴性
P:positive（待测吸光度值）
N:negative
四.ELISA试验的影响因素
（一）固相载体
常用固相载体材料：聚苯乙烯。其特点为吸附Ag或Ab的能力强，一但吸附后，不能被洗脱。
固相载体：酶标板可分软、硬板
一次性使用，不可回收
酶标板要求：
吸附性能好、空白值低、透明度高
板批间、孔间性能相近

（二）抗原、抗体
Ag：需纯化
Ab：需效价高、亲和力强、纯化