检测轮状病毒A组的组合物、试剂盒及方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102260752A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102260752A(43)申请公布日2011.11.30(21)申请号201110246065.0(22)申请日2011.08.25(71)申请人成都新基因格生物科技有限公司地址610041四川省成都市高新区高朋大道5号创业中心(72)发明人王玲汪耀(74)专利代理机构泰和泰律师事务所51219代理人杨兵魏常巍(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)G01N21/64(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表1页附图1页(54)发明名称检测轮状病毒A组的组合物、试剂盒及方法(57)摘要本发明公开了一种检测轮状病毒A组的组合物，属于生物技术领域，包括下述引物5’-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCC-3’和5’-AAYTGYGGTATATTCAATACCATACA-3’还包括探针：5’-荧光报告基团AARGAGCTAWCCGYTAGCCAGACGG-荧光淬灭基团-3’，还公开了包含上述引物和探针的试剂盒及应用其检测轮状病毒A组的方法，利用本发明的组合物、试剂盒和/或方法对轮状病毒A组进行检测时，检测范围为108～101拷贝基因组当量/反应体系，该检测快速简便，整个反应在3小时内完成，并且特异性高，准确度高。CN102675ACCNN110226075202260756A权利要求书1/1页1.一种检测轮状病毒A组的组合物，其特征在于：包括下述引物：P1：5’-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCC-3’，P2：5’-AAYTGYGGTATATTCAATACCATACA-3’，其中，Y为C或T。2.根据权利要求1所述的检测轮状病毒A组的组合物，其特征在于：所述的组合物中还包括下述探针：Probe：5’-荧光报告基团AARGAGCTAWCCGYTAGCCAGACGG-荧光淬灭基团-3’，其中R为A或G，Y为C或T，W为A或T。3.根据权利要求2所述的检测轮状病毒A组的组合物，其特征在于：其中所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为Eclipse。4.一种检测轮状病毒A组的试剂盒，其特征在于：包括病毒RNA逆转录反应体系、PCR反应体系和权利要求1-3中任一项所述的组合物。5.根据权利要求4所述的检测轮状病毒A组的试剂盒，其特征在于：所述PCR反应体系为实时荧光PCR反应体系。6.一种检测轮状病毒A组的方法，其特征在于：依次包括以下步骤：提取样品中的病毒RNA；使用权利要求1-3中所述的组合物和使用权利要求4或5所述的试剂盒，用PCR法扩增所述病毒相应核酸序列；反应的结果进行分析：上述步骤（2）实时荧光PCR反应的结果进行分析，得出检测结论。7.根据权利要求6所述的检测轮状病毒A组的方法，其特征在于：所述的PCR法为实时荧光PCR法。8.根据权利要求7所述的检测轮状病毒A组的方法，其特征在于：所述实时荧光PCR反应体系：反应体系为20μl,包括5×PCR缓冲液4??l、10mmol/LdNTP0.8??l、20??mol/L引物各0.4??l、10??mol/L探针各0.4??l、QIAGEN逆转录酶和聚合酶混合物0.8??l、模板2ul，加灭菌水至终体系20??l。9.根据权利要求6所述的检测轮状病毒A组的方法，其特征在于：所述PCR法的循环参数为：50℃，逆转录30min；95℃，10min;进入循环阶段：95℃变性15s，56℃退火延伸1min，共反应40个循环，退火延伸阶段采集荧光信号。2CCNN110226075202260756A说明书1/5页检测轮状病毒A组的组合物、试剂盒及方法技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种特异性检测病毒的组合物、试剂盒和检测方法。背景技术[0002]轮状病毒主要感染人体小肠上皮细胞，从而造成细胞损伤，引起腹泻，病程一般为一周左右，发热持续3天，呕吐2～3天，腹泻5天，严重者出现脱水症状。引起小儿秋冬腹泻的轮状病毒主要属A组，成人轮状病毒多为B组，A、B组形态上无法区分。全世界每年因轮状病毒A组感染导致的婴幼儿死亡的人数大约为90万人，其中大多数发生在发展中国家。在我国，2岁以内的婴幼儿约为4000万人，每年大约1000万婴幼儿患轮状病毒感染性胃肠炎，占婴幼儿人数的1/4，是引起婴幼儿严重腹泻的最主要病原。[0003]轮状病毒为双链RNA病毒，球形颗粒，直径70nm，结构稳定，耐热，耐酸碱，表面有血凝素，培养较困难。轮状病毒是由粪口路径传播，也有可能经由呼吸路径传染。受感染者每毫克粪便中可以包含上亿个有传染性的病毒颗粒，其中只要10个到100个病毒颗粒就可以具备传播