一种新型重组蜂毒多肽及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108623668A(43)申请公布日2018.10.09(21)申请号201810575627.8A61K38/17(2006.01)(22)申请日2018.06.06A61P35/00(2006.01)A61P31/20(2006.01)(66)本国优先权数据201711223623.52017.11.29CN(71)申请人吉林大学地址130012吉林省长春市前进大街2699号(72)发明人许天敏(74)专利代理机构长春吉大专利代理有限责任公司22201代理人姜姗姗(51)Int.Cl.C07K14/435(2006.01)C12N15/12(2006.01)权利要求书1页说明书12页C12N15/81(2006.01)序列表1页附图4页(54)发明名称一种新型重组蜂毒多肽及其制备方法和应用(57)摘要本发明涉及一种新型重组蜂毒多肽，氨基酸序列为SEQIDNo.1，编码新型重组蜂毒蛋白的核苷酸序列为SEQIDNo.2，制备方法为将UA8短肽与蜂毒肽基因相连接成重组蜂毒融合基因，构建重组蜂毒多肽融合基因真核表达载U-melittin-pPICZα，转入毕赤酵母诱导表达重组蜂毒蛋白并进行表达和纯化，本发明相对于蜂毒肽具有更强的抗肿瘤活性和较小的溶血毒性，应用于由于HPV病毒引起的宫颈相关疾病及宫颈癌的预防及治疗。CN108623668ACN108623668A权利要求书1/1页1.一种新型重组蜂毒多肽，其特征在于：氨基酸序列为SEQIDNo.1。2.编码如权利要求1所述的新型重组蜂毒多肽的核苷酸序列为SEQIDNo.2。3.如权利要求1所述的新型重组蜂毒多肽的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：一.合成SEQIDNo.2：将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5’-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基，合成DNA原料亚磷酰胺保护核酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，使其3'端活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应，接下来进行带帽反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止后续反应，最后在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯，重复以上步骤直到所需的所有碱基被接上去，最后进行纯化得到新型重组蜂毒蛋白编码的核苷酸序列；二.构建重组蜂毒融合基因真核表达载体骨架U-melittin-pPICZα，以SacII酶切位点ccgcgg，SacII的粘性末端被添加于5'端，EcoRI的终止密码子和粘性末端被添加到3'；后进行如下反应，6μl0.5mmolNaCl和25μmol步骤一中制得的融合基因混合，混合物于80℃反应3min接着逐渐降至室温，pPICZαC质粒被SacII和EcoRI剪切，将制备完成的DNA片段插入pPICZαC载体，将重组质粒转入EscherichiacoliXL-Blue的细胞，携带重组质粒的克隆通过25μg/ml的博莱霉素抗性筛选，0.8％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收PCR产物，取20～25μg表达载体骨架U-melittin-pPICZα经SacI酶消化后，用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀，线性化的重组表达质粒溶解后置冰上备用；三.建立新型重组蜂毒多肽的表达体系：从毕赤酵母X-33的YPD阴性培养板上挑取单个菌落，接种于5mlYPD培养基中，250rpm，30℃震荡培养8小时，以常规制备酵母感受态细胞；然后取80μl上述感受态菌，与20～25μg步骤二中制得的线性化的重组表达质粒混合后进行电转化；取50～100μl转化后的菌液涂布于含Zeocin(100μg/ml)的YPD平板上，30℃培养箱培养2～3天；然后用PCR方法筛选转化酵母菌；离心回收菌体后，以玻璃珠法提取酵母基因组DNA并进行PCR鉴定，扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳；四.新型重组蜂毒多肽的表达：取步骤三中鉴定结果阳性的克隆接种于10mlBMGY，pH为6.0培养基中，30℃震荡培养24小时，至OD600达到2.0～6.0时收集细胞，用等体积(10ml)BMMY，pH为6.0重悬细胞沉淀，30℃震荡培养，诱导表达；诱导过程中，每24小时补充一次甲醇至终浓度0.5％，同时补充灭菌超纯水，使发酵液总体积保持不变；在培养的第0、24、48、72、96、120、144和168小时等时间点各取0.5ml发酵液，离心取上清液。4.如权利要求1所述的新型重组蜂毒多肽在治疗HPV感染及抗宫颈癌药物中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的宫颈癌来自于宫颈癌细胞系Hela(HPV18)、Caski(HPV16)。2CN108623668A说明书1